选修一生物技术实践知识点梳理(2)

选修一生物技术实践知识点梳理

　　专题二 微生物的培养与应用

　　课题一 微生物的实验室培养

　　·培养基：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质，是进行微生物培养的物质基础。

　　·培养基按照物理性质可分为液体培养基 半固体培养基和固体培养基。在液体培养基中加入凝固剂琼脂(是从红藻中提取的一种多糖，在配制培养基中用作凝固剂)后，制成琼脂固体培养基。微生物在固体培养基表面生长，可以形成肉眼可见的菌落。根据菌落的特征可以判断是哪一种菌。液体培养基应用于工业或生活生产，固体培养基应用于微生物的分离和鉴定，半固体培养基则常用于观察微生物的运动及菌种保藏等。

　　·按照成分培养基可分为人工合成培养基和天然培养基。合成培养基是用成分已知的化学物质配制而成，其中成分的种类比例明确，常用于微生物的分离鉴定。天然培养基是用化学成分不明的天然物质配制而成，常用于实际工业生产。

　　·按照培养基的用途，可将培养基分为选择培养基和鉴定培养基。选择培养基是指在培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物生长，促进所需要的微生物的生长。鉴别培养基是根据微生物的特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品配制而成的，用以鉴别不同类别的微生物。

　　·培养基的化学成分包括 水 、 无机盐 、 碳源 、 氮源 (生长因子)等。

　　·碳源：能为微生物的代谢提供碳元素的物质。如CO2、NaHCO3等无机碳源;糖类、石油、花生粉饼等有机碳源。异养微生物只能利用有机碳源。单质碳不能作为碳源。

　　·氮源：能为微生物的代谢提供氮元素的物质。如N2、NH3、NO3-、NH4+(无机氮源)蛋白质、氨基酸、尿素、牛肉膏、蛋白胨(有机氮源)等。只有固氮微生物才能利用N2。

　　·培养基还要满足微生物生长对PH、特殊营养物质以及氧气的要求。例如，培养乳酸杆菌时需要在培养基中添加维生素，培养霉菌时须将培养基的pH调至酸性，培养细菌是需要将pH调至中性或微碱性，培养厌氧型微生物是则需要提供无氧的条件

　　·无菌技术·获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵，要注意以下几个方面：

　　①对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒。

　　②将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌。

　　③为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行。

　　④实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。

　　无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的?

　　答：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。

　　·消毒与灭菌的区别

　　消毒指使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物(不包括芽孢和孢子)。消毒方法常用煮沸消毒法，巴氏消毒法(对于一些不耐高温的液体)还有化学药剂(如酒精、氯气、石炭酸等)消毒、紫外线消毒。

　　灭菌则是指使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。灭菌方法有灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌。

　　灭菌方法：

　　①接种环、接种针、试管口等使用灼烧灭菌法;

　　②玻璃器皿、金属用具等使用干热灭菌法，所用器械是干热灭菌箱 ;

　　③培养基、无菌水等使用高压蒸汽灭菌法，所用器械是高压蒸汽灭菌锅 。

　　④表面灭菌和空气灭菌等使用紫外线灭菌法，所用器械是紫外灯 。

　　(1)方法步骤：计算、称量、溶化、灭菌、倒平板。　　制作牛肉膏蛋白胨固体培养基

　　(2)倒平板操作的步骤：

　　①将灭过菌的培养皿放在火焰旁的桌面上，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拔出棉塞。

　　②右手拿锥形瓶，将瓶口迅速通过火焰。

　　③用左手的拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，右手将锥形瓶中的培养基(约10～20mL)倒入培养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖。

　　④等待平板冷却凝固，大约需5～10min。然后，将平板倒过来放置，使培养皿盖在下、皿底在上。

　　·倒平板操作的讨论

　　1.培养基灭菌后，需要冷却到50℃左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度?

　　提示：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。

　　2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰?

　　答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。

　　3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置?

　　答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，将平板倒置，既可以防止培养基表面的水分过度地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。

　　4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗?为什么?

　　答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。

　　纯化大肠杆菌

　　(1)微生物接种的方法最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法。

　　(2)平板划线法是通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作。将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在数次划线后培养，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体，这就是菌落。

　　(3)稀释涂布平板法是将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。分为系列稀释操作和涂布平板操作两步。

　　(4)用平板划线法和稀释涂布平板法接种的目的是：使聚集在一起的微生物分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落，以便于纯化菌种。

　　(5)平板划线法操作步骤：

　　①将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环烧红。②在火焰旁冷却接种环，并打开棉塞。

　　③将试管口通过火焰。④将已冷却的接种环伸入菌液中蘸取一环菌液。

　　⑤将试管通过火焰，并塞上棉塞。⑥左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线，盖上皿盖。注意不要划破培养皿。⑦灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划线的末端开始往第二区域内划线。重复以上操作，在三、四、五区域内划线。注意不要将最后一区的划线与第一区相连。⑧将平板倒置放入培养箱中培养。

　　·平板划线操作的讨论

　　1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环?在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗?为什么?

　　答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物;每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。

　　2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线?

　　答：以免接种环温度太高，杀死菌种。

　　3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线?

　　答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。

　　(6)涂布平板操作的步骤：

　　①将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。②取少量菌液，滴加到培养基表面。

　　③将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃尽后，冷却8～10s。

　　④用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。

　　涂布平板操作的讨论

　　涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第2步应如何进行无菌操作?

　　提示：应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围;等等。

　　菌种的保存

　　(1)对于频繁使用的菌种，可以采用临时保藏的方法。

　　①临时保藏方法

　　将菌种接种到试管的固体斜面培养基上，在合适的温度下培养。当菌落长成后，将试管放入4℃的冰箱中保藏。以后每3～6个月，都要重新将菌种从旧的培养基上转移到新鲜的培养基上。

　　②缺点：这种方法保存的时间不长，菌种容易被污染或产生变异。

　　(2)对于需要长期保存的菌种，可以采用甘油管藏的方法。

　　在3mL的甘油瓶中，装入1mL甘油后灭菌。将1mL培养的菌液转移到甘油瓶中，与甘油充分混匀后，放在-20℃的冷冻箱中保存。

　　疑难解答

　　(1)生物的营养

　　营养是指生物摄取、利用营养物质的过程。营养物质是指维持机体生命活动，保证发育、生殖所需的外源物质。

　　人及动物的营养物质：水、无机盐、糖类、脂质、蛋白质、维生素六类。

　　植物的营养物质：矿质元素、水、二氧化碳等三类。

　　微生物的营养物质：水、无机盐、碳源、氮源及特殊营养物质五类。

　　(2)确定培养基制作是否合格的方法

　　将未接种的培养基在恒温箱中保温1～2天，无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。

　　课题二 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

　　尿素 是一种重要的农业氮肥，尿素并不能直接被农作物吸收。只有当土壤中的细菌将尿素分解成氨之后，才能被植物利用。土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为他们能合成脲酶

　　尿素最初是从人的尿液中发现的

　　筛选菌株

　　(1)实验室中微生物的筛选应用的原理

　　人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。

　　(2)选择性培养基

　　在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称作选择培养基。

　　(3)配制选择培养基的依据

　　根据选择培养的菌种的生理代谢特点加入某种物质以达到选择的目的。例如，培养基中不加入有机物可以选择培养自养微生物;培养基中不加入氮元素，可以选择培养能固氮的微生物;加入高浓度的食盐可选择培养金黄色葡萄球菌等。

　　统计菌落数目

　　(1)测定微生物数量的常用方法有稀释涂布平板法和显微镜直接计数。

　　(2)稀释涂布平板法统计样品中活菌的数目的原理

　　当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活细菌。为了保证结果准确，一般设置3～5个平板，选择菌落数在30～300的平板进行计数，并取平均值。统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，因此，统计结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。

　　采用此方法的注意事项：1.一般选取菌落数在30~300之间的平板进行计数

　　2.为了防止菌落蔓延，影响计数，可在培养基中加入TTC(在计数琼脂中加入适量的TTC(0.5% TTC 1ML加到100ML琼脂中),细菌菌落长成红颜色,对去除食品本底颗粒物干扰非常有意义).

　　3.本法仅限于形成菌落的微生物

　　设置对照

　　设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。对照实验是指除了被测试的条件以外，其他条件都相同的实验，其作用是比照试验组，排除任何其他可能原因的干扰，证明确实是所测试的条件引起相应的结果。

　　实验设计

　　实验设计包括实验方案，所需仪器、材料、用具和药品，具体的实施步骤以及时间安排等的综合考虑和安排。

　　(1)土壤取样：同其他生物环境相比，土壤中的微生物，数量最大，种类最多。在富含有机质的土壤表层，有更多的微生物生长。从富含有机物、潮湿、pH≈7的土壤中取样。铲去表层土，在距地表约3～8cm的土壤层取样。

　　(2)样品的稀释：样品的稀释程度将直接影响平板上生长的菌落数目。在实际操作中，通常选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落数在30~300之间、适于计数的平板。

　　测定土壤中细菌的数量，一般选用104 105 106

　　测定放线菌的数量，一般选用103 104 105

　　测定真菌的数量，一般选用102 103 104

　　(3)微生物的培养与观察

　　不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。细菌30~37℃ 1~2天

　　放线菌25~28℃ 5~7天 霉菌25~28℃ 3~4天

　　每隔24小时统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，这样可以防止因培养时间不足而导致一楼菌落的数目。一般来说，在一定的培养条件下(相同的培养基、温度及培养时间)，同种微生物表现出稳定的菌落特征。形状、大小、隆起程度、颜色

　　疑难解答

　　(1)如何从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数?

　　统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好能统计3个平板，计算出平板菌落数的平均值

　　每克样品中的菌落数=(C/V)*M 其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数

　　课题三 分解纤维素的微生物的分离

　　纤维素，一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，是地球上含量最丰富的多糖类物质。

　　纤维素与纤维素酶

　　(1)棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物，木材、作物秸秆等也富含纤维素。

　　(2)纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。纤维素最终被水解成葡萄糖，为微生物的生长提供营养。

　　纤维素分解菌的筛选

　　(1)筛选方法：刚果红染色法。能够通过颜色反应直接对微生物进行筛选。

　　(2)刚果红染色法筛选纤维素分解菌的原理

　　刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物。当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红-纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。这样，我们就可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。

　　分离分解纤维素的微生物的实验流程

　　土壤取样→选择培养(此步是否需要，应根据样品中目的菌株数量的多少来确定)→梯度稀释→将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上→挑选产生透明圈的菌落

　　(1)土壤采集 选择富含纤维素的环境。

　　(2)刚果红染色法分离纤维素分解菌的步骤 倒平板操作、制备菌悬液、涂布平板

　　(3)刚果红染色法种类

　　一种是先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应，另一种是在倒平板时就加入刚果红。

　　课题延伸

　　对分解纤维素的微生物进行了初步的筛选后，只是分离纯化的第一步，为确定得到的是纤维素分解菌，还需要进行发酵产纤维素酶的实验，纤维素酶的发酵方法有液体发酵和固体发酵两种。纤维素酶的测定方法，一般是对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的葡萄糖进行定量的测定。

　　疑难解答

　　(1)为什么要在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌?

　　由于生物与环境的相互依存关系，在富含纤维素的环境中，纤维素分解菌的含量相对提高，因此从这种土样中获得目的微生物的几率要高于普通环境。

　　(2)将滤纸埋在土壤中有什么作用?你认为滤纸应该埋进土壤多深?

　　将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对聚集，实际上是人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境。一般应将纸埋于深约10cm左右腐殖土壤中。

　　(3)两种刚果红染色法的比较

　　方法一是传统的方法，缺点是操作繁琐，加入刚果红溶液会使菌落之间发生混杂;其优点是这样显示出的颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用。方法二的优点是操作简便，不存在菌落混杂问题，缺点是由于纤维素和琼脂、土豆汁中都含有淀粉类物质，可以使能够产生淀粉酶的微生物出现假阳性反应。但这种只产生淀粉酶的微生物产生的透明圈较为模糊，因为培养基中纤维素占主要地位，因此可以与纤维素酶产生的透明圈相区分。方法二的另一缺点是：有些微生物具有降解色素的能力，它们在长时间培养过程中会降解刚果红形成明显的透明圈，与纤维素分解菌不易区分。

　　(4)为什么选择培养能够“浓缩”所需的微生物?

　　在选择培养的条件下，可以使那些能够适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖，而那些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“浓缩”的作用。