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玉米须对2型糖尿病模型大鼠降糖机制讨论
玉米须是禾本科玉蜀黍属植物玉米stigma maydis L.的花柱和柱头，含有甾醇、多糖、皂苷、黄酮等化学成分，具有降血糖、抗氧化、抗肿瘤及免疫调节等作用，民间常以玉米须做药茶用于糖尿病、高血压病的辅助治疗。目前，玉米须的降糖机制研究集中于其能够促进肝糖原、肌糖原的合成及保护胰岛细胞等功能，而对2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)因脂质代谢紊乱诱发的胰岛素抵抗研究尚不充分。富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白(secreted protein acidic and rich in cysteine，SPARC)是一种组织细胞分泌性基质蛋白，是引起胰岛素抵抗的一个诱因。本研究通过建立T2DM大鼠模型，考察玉米须对模型大鼠脂肪组织SPARC表达的影响，并观察胰腺病理结构的改变，探讨玉米须治疗糖尿病的作用机制。
材料
1. 药材与试剂 玉米须药材购于安国市奉义中药饮片有限公司，经黑龙江省中医药科学院王伟明教授鉴定为玉米须stigma maydis L.;链脲佐菌素(STZ，美国Sigma公司);血糖试纸(罗氏公司);RNA提取试剂(Trizol);RNA逆转录试剂盒(TaKaRa);PCR试剂盒(TaKaRa);SPARC及内参(-actin)引物(Invitrogen公司);蛋白裂解液及BCA试剂盒(中国碧云天生物试剂公司);内参(-actin)抗体及SPARC单克隆抗体(Abcam公司);内参二抗及SPARC二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司);ECL显色试剂盒(英国安马西亚公司)。
2 . 仪器 AC C U- C H E K型血糖仪(德国罗氏公司);LineGene 9600聚合酶链式反应(PCR)仪(杭州博日科技有限公司);VersaDoc MP 5000凝胶成像仪(BIO-RAD公司);TY10170-3930型WESTERN BLOT湿法转膜仪(BIO-RAD公司);DYCZ-24DN型电泳仪(北京六一公司);infinite M200PRO酶标仪(瑞士Tecan公司)。
3. 动物及饲料 SPF级SD雄性大鼠，体质量(20020)g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，生产许可证号：SCXK(京)2012-0001，合格证号：11400700049303;高脂饲料由实验室按如下配方配制：基础饲料79.5%、蛋黄粉10%、猪油10%、猪胆盐0.5%。
1. 玉米须提取物的制备
称取玉米须500g，将其切短，用10倍量水室温浸泡10h，于80℃水浴中浸提2次，每次3h，过滤，合并滤液，于80℃减压浓缩并真空干燥，保存于-20℃备用。临用时，取适量加蒸馏水溶解配制成0.1g/mL的溶液。
2. 糖尿病模型的建立
参考文献方法。40只大鼠随机分笼，适应性饲养1周，期间自由进食基础饲料，自由饮水。除正常组(10只)给予基础饲料喂养外，其余大鼠给予高脂饲料喂养4周后，禁食不禁水16h，每只大鼠按35mg/kg剂量一次性腹腔注射2%STZ工作液(4℃预冷的0.1mmol/L柠檬酸缓冲液新鲜配制，避光，pH值4.5)。正常组则注射相应剂量的柠檬酸缓冲液，分别于注射后3、7d测定空腹血糖，空腹血糖11.1mmol/L维持3d者，确定为T2DM模型，不成模者弃去。
3. 分组、给药、取材
将造模成功的20只大鼠随机分为两组，即模型组和给药组，每组10只。正常组和模型组给予蒸馏水灌胃，给药组灌胃给予玉米须提取物，给药量按照《中华人民共和国卫生部药品标准》1985年版一部规定的成人日用量最大30g折算成标准200g大鼠的给药量为2.7g/kg。给药组间，正常组给予普通饲料，模型组及给药组大鼠继续喂以高脂饲料4周至实验结束。连续给药4周后，通过每组大鼠尾静脉采血测定空腹血糖，然后用水合氯醛腹腔注射麻醉，分别取腹部脂肪组织立即置入液氮中，最后放入-80℃冰箱保存备用，另取各组大鼠胰腺，用滤纸吸干表面水分，立即放入10%甲醛溶液中固定用于病理组织检查。
4. 胰腺组织病理学观察
将10%甲醛固定的胰腺组织采用常规石蜡包埋切片，HE染色，光镜检查，观察胰腺组织病理变化。
5. RT-PCR法检测各组大鼠脂肪组织中
SPARC mRNA的表达 取脂肪组织50mg，加1mL Trizol试剂提取总RNA。用酶标仪测定RNA的浓度和纯度，采用荧光定量PCR法检测不同组别大鼠脂肪组织SPARC mRNA表达水平。目的基因SPARC的上游引物序列：5-GAA GGT ATA TGC AGC AAT GAC AAC AA-3，下游引物序列：5-TTC GGT CAG CTC GGA ATC CA-3。-actin(内参)上游引物序列：5-CCC AGC ACA ATG AAGATC AAG ATC AT-3，下游引物序列：5-ATC TGC TGG AAGGTG GAC AGC GA-3。RT反应体系20L，37℃温育15min，85℃加热5s，5℃保持5min终止反应。PCR扩增采用50L反应体系。PCR方案：预变性阶段：95℃ 30s;PCR反应阶段：95℃5s，60℃ 20s，共40个循环，同时扩增-actin作为内参。根据相对定量法2-CT法对扩增结果进行数据分析。
6. Western blot法检测各组大鼠脂肪组织SPARC蛋白的表达
将冻存的脂肪组织加入液氮研磨后加入蛋白裂解液，10 000r/min离心5min后取上清液。用BCA法测定蛋白浓度。取约60g总蛋白加入SDS-PAGE凝胶槽中，首先经恒压50V、30min后，当溴酚蓝到达浓缩胶与分离胶的界面时电压提高至100V，直至溴酚蓝到达分离胶底部。湿法转膜：恒流200mA，90min。5%BSA封闭2h，按照1∶1 000稀释一抗，4℃孵育过夜，1∶2 000稀释二抗孵育90min，然后经ECL化学发光系统显色,用Quantity one软件处理条带的灰度值。以SPARC/-actin代表SPARC蛋白的相对表达量。
7. 统计学方法
对实验数据进行统计分析，以x-s表示，采用SPSS 12.0软件进行统计分析，两组间差异比较采用t检验，以P0.05为差异有统计学意义。
结果
1. 玉米须提取物对大鼠血糖的影响。与正常组比较，模型组大鼠空腹血糖明显升高(P与模型组比较，给药组大鼠空腹血糖明显下降(P0.05)。
2. 玉米须提取物对大鼠胰腺病理结构的影响 。正常组外分泌腺与胰岛之间界限清晰，胰岛细胞密度高，形态规则;模型组胰岛受损严重，周界不清，形态不规则，胞核固缩，体积缩小，胰岛细胞胞浆内有空泡，胰岛外出现大面积脂肪异位沉积;给药组外分泌腺与胰岛周界清楚，形态比较规则，胰岛细胞结构基本正常，排列规则整齐，胰岛细胞密度较模型组有较大增加，胰岛外仍有脂肪沉积，胰岛细胞胞浆内几无空泡。中华中医药杂志(原中国医药学报)2016年10月第31卷第10期 CJTCMP , October 2016, Vol . 31, No. 10 4255
3. 玉米须提取物对T2DM模型大鼠脂肪组织SPARC mRNA表达的影响 见表2。RT-PCR检测结果显示：与正常组比较，模型组大鼠脂肪组织中SPARC mRNA大量表达(P0.05)，给药组大鼠脂肪组织中SPARC mRNA表达显著低于模型组(P0.05)。
讨论
SPARC是一种与T2DM的发病密切相关的小分子糖蛋白，Nie J等研究表明，SPARC能够抑制脂肪合成，促进脂肪纤维化，一方面游离脂肪酸在体循环中通过抑制胰岛素刺激对葡萄糖的摄取利用及阻断胰岛素信号通路引起胰岛素抵抗，另一方面当游离脂肪酸沉积于非脂肪组织中时形成异位脂肪沉积进而引起非脂肪组织的胰岛素抵抗，如当沉积于胰脏时产生脂毒性而对胰岛细胞产生损伤，同时SPARC抑制脂肪合成时会导致脂肪细胞病理性肥大，从而诱发脂肪组织炎性反应，导致脂肪组织的炎性因子如IL-6、TNF-等聚集增加，这些炎性因子除了本身可以通过阻断胰岛素信号通路及减少GLUT4的表达加重胰岛素抵抗外，又会加重脂肪的异位沉积。且研究表明，糖尿病患者血清的SPARC含量高于正常人，而脂肪组织炎性反应、胰岛素、瘦素为调节SPARC含量升高的主要因素，升高的SPARC又会导致异位沉积、脂肪组织炎性反应最终导致胰岛素抵抗从而形成一个恶性循环。玉米须作为我国传统的中药材，最早收载于《滇南本草》，对糖尿病具有一定的辅助治疗作用。本实验结果表明，玉米须提取物能够降低T2DM模型大鼠血糖水平，并且因脂肪异位沉积于胰脏对胰岛细胞产生的损伤具有一定的修复作用，通过RT-PCR和Western blot技术检测到给药组脂肪组织SPARC的mRNA和蛋白表达显著下降，说明玉米须提取物降低血糖改善胰岛素抵抗的机制可能与其抑制SPARC的表达相关。SPARC含量下降进而减弱其在T2DM模型病大鼠脂肪组织中抑制脂肪合成促进脂肪纤维化的作用，因而减轻了脂肪异位沉积的程度。
脏腑辨证治疗2 型糖尿病胰岛素抵抗的研究进度
胰岛素抵抗( insulin resistance， IR) 是指由遗传和环境因素导致的机体胰岛素作用的靶器官、组织对胰岛素的敏感性及反应性下降，即胰岛素促进葡萄糖的吸收、摄取和利用作用受损，导致机体引发代偿性胰岛素分泌增多的一种病理生理状态。Haffner 等报道: 胰岛素抵抗在2 型糖尿病中占绝大多数( 92%) 。近年来，医学界治疗糖尿病的热点趋向于针对胰岛素抵抗的治疗，西药在治疗2 型糖尿病IR方面，由于其价格较贵，治疗形式较为单一，并且也有一定副作用，所以使用西药治疗仍然存在局限性。因此，笔者总结临床经验并查阅文献，发现中医药在治疗糖尿病IR 具有一定优势。中医学综合其症候特点，认为本病应属于消渴范畴，因此胰岛素抵抗的病因与消渴一样不外乎禀赋不足，五脏柔弱; 情志不遂，化火伤阴; 饮食失节，酿热耗津; 劳逸失度，耗气伤阴等。传统消渴的上消、中消、下消分型提示消渴病变的脏腑主要在肺、胃、肾。因现代生活方式的改变，如热量摄入过多、运动量减少及生活压力大等方式派生糖、脂代谢紊乱，使得现在人们2 型糖尿病、肥胖症等患病率逐年升高，这意味着胰岛素抵抗的患者人数也随之逐级增长。特别是消渴病三多一少症状表现得非典型化，传统的三消理论在指导治疗2 型糖尿病IR 上已经存在明显的不足，正如当今医家更喜欢从肝、脾、肾3 脏进行脏腑辨证，结合本病的病因病机来确定相应治则治法，以获得最佳的治疗效果。
1 中医藏象学说对2 型糖尿病胰岛素抵抗病因病机概述
早在《黄帝内经》就有记载: 肝主筋，肾主骨，脾主肉，心主脉，肺主皮毛。《素问痿论》云: 脾主身之肌肉。意即胰岛素作用的靶组织( 全身的肌肉) ，都有赖于脾胃运化的水谷精微及津液的营养滋润，脾气的运化功能与肌肉功能发挥之间有着密切的联系，这尤为符合临床上肌肉体型不论胖瘦的胰岛素抵抗、高胰岛素血症及2 型糖尿病患者的特征表现。《灵枢本脏》云: 脾脆则善病消瘅易伤。《素问通评虚实论》曰: 消瘅肥贵人，则膏粱之疾也。更是言明肥贵人易患消瘅。在此消瘅可意为肥胖型2 型糖尿病。《素问奇病论》亦有此肥美之所发也，此人必数食甘美而多肥也，肥者令人内热，甘者令人中满，故其气上溢，转为消渴之说。现代人常因饮食不节，长期嗜好肥甘厚味，损伤脾胃，水谷不化，水湿痰浊内生，导致肥胖。肥胖的临床特点是体重增加和脂肪异常堆积，皮下脂肪与内脏脂肪是导致胰岛素抵抗、2 型糖尿病及血脂异常的重要因素。这些观点与现代医学认为脂肪组织对胰岛素的敏感性下降而表现胰岛素抵抗的观念不谋而合。中医自古就有肥人多痰肥人多湿肥人多气虚的经验之谈。肾阳虚则不能温煦脾土，水谷之精不布易生痰湿，即痰、湿的生成主要责之脾、肾2 脏，脾肾阳虚、气虚是肥胖型糖尿病的本质。刘学等认为: 肾阴亏虚则虚火内生，中灼脾胃致消谷善饥出现形体( 肌肉) 消瘦之征。由此可见，肾阴肾阳偏颇对肌肉组织、脂肪组织的形成息息相关。《难经》曰: 肝之积，名日肥气。这里的肥气可指脂肪、肥膏、油脂，即肝脏积聚、储存了太多的肥脂之气。较为明白地阐述了现代人因生活压力大，易因肝气郁结、情志失调而暴饮暴食致肥胖、脂肪肝、胰岛素抵抗等现象。宋修道认为: 肝的疏泄功能对脏腑气机、脾胃运化及水液代谢均有调节作用，因此消渴的发生与肝之疏泄失常，气机不畅，郁而化火，导致脾失健运，肾失封藏; 痰浊水湿互结，内蓄脏腑有关。
2 脏腑辨证对2 型糖尿病胰岛素抵抗的论治随着科学检验手段的进步，治疗方法的传承与创新，现代中医学对糖尿病的辨证论治已经不仅仅局限于三消分治。从肝、脾、肾3 脏研究2 型糖尿病胰岛素抵抗的中医药治疗得到越来越多临床医师的关注，临床研究得以逐步深入。
2. 1 从脾论治2 型糖尿病胰岛素抵抗
郑本达认为: 糖尿病、胰岛素抵抗、脂代谢异常是3个互相关联的危险因素。糖尿病合并高脂血症病理环节与脾气亏虚、痰湿壅阻密切相关，证属脾虚痰湿证。治疗上可以采用经验方参芪玉荷方( 党参、黄芪、白术、苍术、玉米须、荷叶、茯苓、法半夏、陈皮、薏苡仁、生山楂等) 。通过收集观察60 例病例，其中治疗组( 中药组) 30 例，对照组( 二甲双胍组) 30 例。治疗后治疗组患者FINS、HOMA-IR 有所降低，与治疗前对比，差别有统计学意义( P 0. 01) 。治疗后对照组HOMA-IR 有所下降，并与治疗前对比，差别有统计学意义( P 0. 05) ; 与对照组对比，治疗组FINS、HOMA-IR 的改善差别有统计学意义( P 0. 05 或P 0. 01) 。马春玲等[23]将105 例2 型糖尿病患者按2∶ 1 比例随机分为中药组( 自拟温中运脾补肾方) 70 例和对照组( 二甲双胍组) 35 例，治疗8 周后，发现中药组胰岛素敏感性增高( P 0. 05) 、高空腹胰岛素降低( P 0. 05) ; 与对照组比较，在提高胰岛素敏感性、降低高空腹胰岛素方面，中药组也占有优势( P 0. 05) 。这个研究表明: 温中运脾补肾法治疗2 型糖尿病不论在降糖方面，还是在调脂、改善胰岛素抵抗方面，疗效、安全性均较好。
2. 2 从肝论治2 型糖尿病胰岛素抵抗
冉晓丹认为: 2 型糖尿病患者易产生消极态度，发生抑郁情绪，进而影响神经内分泌系统、神经免疫调节系统，产生或加重胰岛素抵抗，这一过程是一个恶性循环。因此，在临床上探讨疏肝解郁法，即运用丹栀逍遥散加味方观察治疗62 例2 型糖尿病合并抑郁症患者胰岛素抵抗的影响，结果显示，中药组患者空腹胰岛素水平下降，体重指数下降，血糖水平得以明显改善，胰岛素敏感指数升高，可降低患者胰岛素抵抗。曾淑惠认为: 糖尿病合并抑郁症属于中医学中消渴郁证等范畴，均属于中医内科学气血津液病证，认可肝、肾在消渴病中的地位，确立了糖忧解郁汤为治疗糖尿病合并抑郁症的治疗方药，进行了60 例的临床观察，得出糖忧解郁汤治疗糖尿病合并抑郁症，证属肾虚肝郁证患者，可得到改善临床症状、糖脂代谢及胰岛素抵抗这一结论。__颖等通过100 例糖肝康治疗糖尿病非酒精性脂肪肝的临床研究，发现治疗组( 糖肝康组) 的胰岛素抵抗指数较对照组更加得到有效改善( P 0. 05 或P 0. 01) ，证实糖肝康对糖尿病非酒精性脂肪肝患者具有整体调节、综合治疗的优势。
2. 3 从肾论治2 型糖尿病胰岛素抵抗
陈玉涛选取60 例同时符合糖尿病胰岛素抵抗及中医气虚血瘀证辨证标准的患者，观察益肾活血胶囊( 仙茅，淫羊藿，黄芪，桃仁，红花，当归等) 治疗与二甲双胍对照的疗效和安全性，经统计学验证后证明，益肾活血胶囊治疗6 个月后自身前后对比IAI、ISI 值差别有统计学意义( P 0. 01) ，而与对照组比较( P 0. 05) ，说明益肾活血胶囊可以改善胰岛素抵抗，增加胰岛素敏感性，疗效优于二甲双胍。阮永队等在临床发现目前2 型糖尿病以真火衰微、脾肾阳虚、脾胃虚寒等阳虚证居多，故不再以阴虚燥热立论。治疗上他认为应以温脾肾、益气补中为法。观察70 例服用温阳健脾汤治疗2 型糖尿病伴高胰岛素血症对比35 例二甲双胍组，结果提高胰岛素敏感指数的有效率，治疗组为78. 57%，对照组为54. 29%，两组比较差别有统计学意义( P 0. 05 或P 0. 01) 。肯定了温阳健脾法对2 型糖尿病胰岛素抵抗的降糖、改善胰岛素抵抗疗效。
3 单味药从脂肪组织、肝、肾对2 型糖尿病胰岛素抵抗作用机制
中药复方的多靶点作用特征可以认为是建立在单味中药的有效成分降糖作用基础上的，因此，临床医生可以根据实验研究及临床经验有效地进行组方选药，发挥中医药特色使其治疗糖尿病有更为明显的优势。目前发现具有改善胰岛素抵抗作用的单味中药多达70 余种，常用的就已有20 余种。如李佳川等从细胞途径探索黄连不同部位、成分改善胰岛素抵抗的药效物质基础，最后经3T3-L1 前脂肪细胞诱导分化试验证实黄连各成分、各部位均呈现抑制前脂肪细胞分化的作用，从而改善胰岛素抵抗。研究还提示: 黄连在增加细胞对葡萄糖摄取的同时也不会造成体重增加，这对临床运用黄连防治胰岛素抵抗相关疾病具有重要意义。张婧等发现经黄芪治疗后可降低DM 大鼠的空腹血糖、血清空腹胰岛素、血脂水平进而起到改善DM 大鼠胰岛素抵抗的作用，推测黄芪对脂肪因子水平的改善IR，并在随后对DM 大鼠肾组织进行免疫组化检测及光镜下病理观察中，证实了黄芪对T2 DM 的肾脏损伤具有一定的保护作用。宁萌等提出麦冬的降糖作用与IR 脂肪细胞分泌的脂肪因子有关，进一步研究证实麦冬多糖抑制脂肪细胞表达抵抗素这类可降低胰岛素敏感性的脂肪因子，以及促进脂肪细胞高表达瘦素、脂联素这些可增强细胞对胰岛素的敏感性的脂肪因子，进而促进脂肪组织对葡萄糖的摄取和利用改善高血糖症状。廖靖等也验证了麦冬提取物可改善胰岛素抵抗这一说法，并且还发现麦冬提取物可降低妊娠期糖尿病胰岛素抵抗小鼠的尿蛋白含量，进而丰富了麦冬的降糖理论机制。赵东永研究表明: 经鱼腥草灌胃治疗的糖尿病小鼠胰岛素抵抗症状得到明显改善，体内致炎因子浓度降低，小鼠炎症水平明显下降，由此认为鱼腥草改善胰岛素抵抗作用可能与其抗炎作用有关。王海颖等用鱼腥草蒸馏液灌胃治疗糖尿病大鼠，发现鱼腥草组与西药组对比，能明显降低大鼠尿蛋白、尿清蛋白( P 0. 05) ，表明鱼腥草具有较好的改善糖尿病大鼠尿清蛋白代谢作用。郑晓珂等进行了桑白皮水煎液及化学拆分组分对昆明种1 型糖尿病小鼠降糖作用的研究，检测血糖、胰岛素、血脂等指标并在光镜下观察小鼠肝脏、胰腺病理形态，实验结果表明: 桑白皮水煎液高剂量组能不同程度地降低血糖、血脂水平( P 0. 05 或P 0. 01) ，增高C 肽水平，提示桑白皮的降糖机制可能与改善胰岛素抵抗、调节糖脂代谢紊乱有关; 并在给药4 周后，治疗组小鼠与模型组小鼠对比，肝组织结构已基本趋于正常，细胞形态得到复原，体现了桑白皮对损伤的肝细胞的修复保护作用。
4 小结
综上所述，关于中医药治疗2 型糖尿病胰岛素抵抗的脏腑辨证论治方面的研究较多，无论是单脏腑治疗，还是联系两个或两个以上脏腑论治，均离不开肝、脾、肾对症分析治疗，各项研究方面均符合中医药理论的整体观。因此，善于利用中医学思维及理论分析IR 的病机，提出适宜的治则治法，再通过现代临床检验手段，将能够给2 型糖尿病胰岛素抵抗患者的治疗带来更大的希望和进展。
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