细胞凋亡学说在帕金森病发病机制的理论探索
【关键词】
帕金森病;发病机制;细胞凋亡
帕金森病(PD)主要症状包括静止性震颤、肌肉僵直、运动迟缓和姿势平衡障碍等，病理变化主要为黑质致密部(DSN)和多巴胺(DA)能神经元选择性变性〔1〕。PD病情呈渐进性的加重过程，患者晚期生活无法自理，最终死于肺部感染等并发症。PD 在中老年人群发病率很高，流行病学调查显示〔2〕，55 岁以上人口 PD 患病率为 1.4%，在 75 岁以上人口达 3.4%。PD 被发现以来其病因到目前仍不明确，有关病因的假说主要有遗传学说和环境毒素学说。随着研究水平的提高，从细胞凋亡理论探索PD的发病机制近几年受到了国内外学术界的关注。
1 PD研究中已克隆出的相关基因与细胞凋亡〔3〕
见表1。这些基因的发现能够解释家族性 PD 的病因，但家族性PD占PD病人的总数还不到10%，其余的大部分都是散发性PD，很难确定其中的遗传因素。环境毒素学说的提出最早开始于1?甲基?4?苯基?1，2，3，6?四氢吡啶(1?methyl?4? phenyl?1，2,3,6?tetrahydropyridine，MPTP)毒性作用的发现〔4〕。人类和非灵长类动物给予MPTP后引起PD的运动缺乏表现，并且伴随着有DSN、DA 能神经元的选择性破坏和DA含量的显著降低。另外，除草剂和杀虫剂的使用与PD的发生呈正相关。鱼藤酮是一种被广泛应用的杀虫剂，能够抑制线粒体复合体Ⅰ的活性。在动物实验中发现，静脉注射鱼藤酮可以选择性造成DA能神经元的死亡，残存神经元内形成一种被称为Lewy小体的物质，并且动物出现类似PD运动障碍的症状〔5〕。这都表明在散发型PD的发病过程中环境因素可能起着重要的作用。虽然遗传学说和环境毒素学说都各有依据，但彼此不能互相否定。许多遗传学的研究不能排除亲缘关系较近的人群受共同生活环境的影响;而环境毒素学说也不能解释为什么接触毒素后仅有少数人出现了PD症状。这就产生了另外一个假说，即大部分PD是在一定的遗传背景下受环境毒素侵害而发病的，但这一学说有待于相关研究的证实。
PD的发病机制尚未明确。目前有关PD发病机制的假说有氧化应激、线粒体损伤、神经兴奋毒性、神经营养缺失、蛋白水解应激、免疫异常、炎症反应、多巴胺转运体失活、α?synuclein异常沉积和细胞凋亡等，其中神经兴奋毒性、氧化应激和细胞凋亡学说较受重视〔6〕。神经兴奋毒性学说认为兴奋型神经递质如谷氨酸(Glu)等大量释放，通过激动α?氨基羟甲恶唑丙酸(AMPA)受体及N?甲基D天门冬酸(NMPA)受体和代谢型Glu受体以及通过膜去极化激活电压依赖性钙通道造成胞内钙超载，最终通过一系列机制导致细胞死亡。氧化应激学说认为PD是由于神经细胞氧化磷酸化过程中所产生的自由基过多或自由基清除功能减弱导致过多的氧自由基攻击某些关键酶、生物膜类脂和DNA，最终导致细胞死亡。PD的发病因素如氧化应激、抗氧化功能缺失和线粒体功能损伤等均可在不同水平诱导神经细胞凋亡〔1〕。
表1 已克隆的PD相关基因
基因名称遗传方式基因位点染色体位点α?synuclein显性遗传PARK1(28)4q21?q23Parkin隐性遗传PARK2(58)6q25.2?27未命名显性遗传PARK3(74)2p13α?synuclein显性遗传PARK4(30，31)4qUchL1显性遗传PARK5(59)4p14未命名隐性遗传PARK6(75)1p35?p36DJ?1隐性遗传PARK7(76)1p36未命名显性遗传PARK8(77)12p11q13.1未命名隐性遗传PARK9(78)1p36未命名迟发易患基因PARK10(79)1p32NR4A2易患基因NA(80)2q22?23Synphilin?1易患基因NA(81)5q23.1?23.3Tau易患基因NA(40)17q21
细胞凋亡又称程序性细胞死亡(PCD)，它是上世纪70年代提出的一种不同于坏死的细胞死亡方式，是有核细胞在一定条件下通过启动自身内部机制，即主要通过内源性DNA内切酶的激活而发生的细胞自然死亡过程，维持组织细胞内环境稳态、将一些多余细胞清除的必不可少机制〔7〕。然而，PCD也是一种病理现象，如在神经退行性疾病中发现有大量的神经元发生凋亡〔1,2〕。PCD是受基因调控的主动的细胞自杀现象，调控PCD的基因有：p53基因、Bcl?2基因家族、c?myc基因和survivin基因等。关于PCD过程中信号转导系统，目前认为主要通路有两条：膜受体通路和线粒体通路。这两条通路的下游途径都是通过激活caspase级联反应，最终导致细胞死亡〔8〕。
2 PD 神经元凋亡的主要诱发因素〔9〕
目前大量的研究表明氧化应激可能在 PD 的发生、神经细胞最终凋亡中发挥重要作用。自由基的生成主要有以下几个方面：①过氧化氢(H2O2)是DA代谢过程中产生的正常代谢副产物。酪氨权羟化酶(TH)催化生成 DA 和单胺氧化酶(MAO?B)降解DA时都有H2O2的生成，DA自身氧化也可产生少量的H2O2，H2O2分解产生·OH。这个过程在铁存在时加速，尤其是Fe2+，用反应式表示为：Fe2++H2O2→Fe3++OH?+·OH，即Fenton反应。在PD患者脑中发现了铁水平的异常升高，而结合Fe2+的铁蛋白的水平则下降。②外源性神经毒素如 MPTP，经胶质细胞内 MAO?B 酶氧化还原形成 MPP+，MPP+经DA转运体摄取至DA神经元内，MPP+抑制线粒体复合体Ⅰ导致呼吸链产生大量的自由基，从而造成对细胞内生物大分子的损伤，导致神经元死亡。③自由基的另一个来源为大脑黑质病变时，一氧化氮合成酶 (NOS) 的表达增加导致一氧化氮(NO)和过氧硝酸盐自由基水平升高。另外，小胶质细胞的激活可增加活性氧簇(ROS)的释放。正常情况下体内有完整的自由基清除体系，包括Vitmain A,C,E,微量元素Se,Zn,Mn和内源性物质包括谷胱甘肽(GSH)、过氧化物歧化酶(SOD)、辅酶Q、NADPH、褪黑素以及尿素等。但在PD患者黑质中发现GSH和总谷胱甘肽(GSH+GSSG)水平降低。Nakamura等〔10〕发现GSH的降低使DA能神经元对MPP+的神经毒效应增敏。使用自由基清除剂可使包括MPP+在内的复合体Ⅰ抑制剂诱导的PCD减少，说明了复合体Ⅰ抑制后产生凋亡的过程包含自由基的生成。在PD患者尸检研究发现〔11〕，患者黑质中脂质过氧化物水平明显升高。因此，导致氧化应激的各种因素的协同作用，包括线粒体功能障碍、DA能代谢产物的增加、铁含量增加以及GSH的耗竭等，可诱发DA能神经元的变性和坏死。
3 PD 神经元凋亡的关键事件
线粒体是细胞的一个独特而重要的细胞器，细胞内氧化磷酸化、能量代谢和抗氧化作用都有赖于线粒体功能的发挥。线粒体亦是PCD调控中心。在凋亡早期，细胞形态改变之前，最早表现为线粒体跨膜电位下降。跨膜电位是线粒体维持正常功能的必备条件。跨膜电位下降后，线粒体膜的渗透性发生改变，引起线粒体肿胀，线粒体膜上的孔或通道增大，使线粒体内的物质外流。细胞色素C从线粒体释放是PCD的关键步骤。释放到胞浆的细胞色素C在dATP存在的条件下能与Apaf?1结合，使其形成多聚体，并促使caspase?9酶原与其结合形成凋亡体，caspase?9酶原被自我活化，活化的caspase?9能激活其他的caspase如caspase?3等，caspase?3水解其底物，从而诱导PCD。在PD患者中可检测到线粒体功能障碍，主要是线粒体复合体Ⅰ受损。复合体Ⅰ位于线粒体内膜，为生成ATP的氧化磷酸化系统的一部分。线粒体功能障碍的原因至今不明，有人认为是编码氧化磷酸化系统某些蛋白的基因发生了突变〔12〕。另外，研究发现〔1〕MPTP和其他外源性杀虫剂也可以损伤线粒体复合体Ⅰ的功能。无论如何，线粒体功能障碍都可导致ATP水平的降低，诱发自由基生成，最终使神经元凋亡。
4 PD神经元凋亡的基因调控〔13〕
①bcl?2家族，Ziv等用PC12细胞系研究发现bcl?2能明显抑制DA氧化产物的生成,并且能阻止细胞内GSH水平下降。Hassouna等发现小鼠经腹膜注射MPTP后，其脑内黑质区bax mRNA合成增加，注药后3 d和6 d分别达到正常的2倍和3倍，在黑质区呈现相应bax免疫反应性的大、中型神经元都发生了坏死。说明MPTP可诱发bax表达,促进凋亡的发生。②p53，p53激活可介导DA诱导细胞凋亡。③c?jun、c?fos转录因子c?jun、c?fos被认为在神经细胞凋亡诱导中发挥着重要作用。但在多种PCD过程中确实存在c?fos的过度表达，但到底是c?fos引起PCD还是PCD同时伴有c?fos的增多，到目前为止还没有确证。④caspase中脑黑质DA能神经元的缺失是PD的主要病理特点。检测PD患者死亡后脑组织时发现，中脑多巴胺能神经元的丢失与Caspase?3阳性神经元呈正相关。在MPTP诱导的小鼠PD模型中，Caspase?3的激活在第1、2天即达高峰，但是到第7天时DA能神经元的丢失才会很明显,说明Caspase的激活是DA能神经元凋亡过程的早期信号。Caspase?3是PD患者和PD动物模型黑质DA能神经元凋亡的易感因子和效应器〔14〕。
综上所述，PCD作为PD的发病机制学说之一，在一定程度上被研究者证实，但人们对于PD病人脑内的DA能神经元是否发生凋亡依然存在争论，这主要有三方面的原因：①PD的病程较长，同一时间内发生退变的神经元数量很少，而典型的PCD形态也只能保持几天，所以在任何一个时间点去观察都很难找到凋亡的形态学证据;②尸检的标本多来自于晚期PD病人，此时病变的DA能神经元大都已经缺失，难以检测;③判定凋亡的标准过于单一，多数的研究仅采用形态学标准，而单一的形态学方法无法准确区分凋亡与坏死。最常用来检测DA能神经元凋亡的方法为TUNEL法，目前认为单纯使用TUNEL法检测病人脑组织所取得的结果可信度很低，例如氧化应激导致细胞坏死的同时也有DNA的断裂，TUNEL检测为假阳性;处于有丝分裂期的胶质细胞可以被d?UTP标记，导致假阳性结果;死后的脑组织如果不能被及时固定会增加非特异性标记，呈假阳性结果，如果固定时间过长引起蛋白质交联则呈假阴性结果;Ca2+和 Mg2+等二价阳离子可以提高d?UTP与DNA 3′末端的亲合力，微小的浓度变化对结果有较大的影响;核酸内切酶的种类较多，作用于DNA产生各种不同的形状的残端，而末端脱氧核酸转移酶与不同的DNA残端结合能力差别较大，使结果变得不稳定。
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