细胞与克隆技术论文(2)

时间：2017-03-16 14:45:33 家文952由分享

　　细胞与克隆技术论文二：重组创伤弧菌溶细胞素单克隆抗体的制备

　　作者：张琦，卢改娜，谢旦立，甄伟春，楼永良

　　【摘要】目的：制备重组创伤弧菌溶细胞素(recombinant Vibrio vulnificus cytolysin，rVVC)鼠源性单克隆抗体，并对其特异性及免疫球蛋白类型进行鉴定，为创伤弧菌溶细胞素(Vibrio vulnificus cytolysin，VVC)致病机制的后续研究及创伤弧菌引起的食品污染中溶细胞毒素快速检测试剂盒的研发奠定基础。方法：IPTG诱导含pET28a(+)-vvhA的大肠杆菌表达rVVC，将rVVC纯化、复性后经甲醛脱毒作为抗原免疫BALB/c小鼠。SDS-PAGE检测蛋白纯化后效果。采用杂交瘤技术和ELISA法制备并筛选分泌rVVC单克隆抗体的杂交瘤细胞株，有限稀释法对阳性孔克隆化培养。采用免疫双扩法鉴定单克隆抗体类型，ELISA法、免疫双扩法鉴定单克隆抗体的特异性。结果：将纯化复性后的rVVC作为抗原免疫小鼠后，经ELISA检测，血清有效稀释度达1:12800。共获得2株可持续分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别为B2C7和E3F4株，其抗体类型均为IgG1，且具有较高特异性，与多种其他细菌蛋白不发生免疫反应。结论：本研究成功免疫BALB/c小鼠，获得B2C7和E3F4两株可持续稳定分泌rVVC鼠源性单克隆抗体的杂交瘤细胞株，抗体类型为IgG1型。

　　【关键词】创伤弧菌;溶细胞素;vvhA基因;杂交瘤;单克隆抗体

　　Abstract: Objective: Mouse-original monoclonal antibody against recombinant Vibrio vulnificus cytolysin (rVVC) was prepared and its specificity and type of immunoglobulin were identified，which can lay a foundation for the further study of Vibrio vulnificus cytolysin (VVC) pathogenesis and the development of rapid detection kit of Vibrio vulnificus cytolysin. Methods:IPTG was used to induce E.coli BL21 (DE3)pET28a(+)-vvhA to express rVVC. The rVVC which purificated，refolded and then detoxi-fied was used to immune BALB/c. The effects of expression and purification of rVVC were determined by SDS-PAGE. The hybridoma cell lines to secrete anti-rVVC monoclonal antibodies were prepared and screened by hybridoma technique and ELISA，and then were cloned with limited dilution. Double immunodiffusion assay was used to identify the type and subclass of monoclonal antibody. ELISA and double immunodiffusion assay were used to determine the specificity. Results:The mice immunized by rVVC which had been purified，refolded and detoxified showed the highest serum dilution to 1:12800 by ELISA. Two cell lines of hybridoma were screened out，and cells of B2C7 and E3F4 were found to be continuously secreting IgG1 monoclonal antibodies. The monoclonal antibodies showed high specificity，and didn’t react with the proteins from other bacteria. Conclusion:BALB/c mice is successfully immunized and two mouse-origin hybridoma cell lines named B2C7 and E3F4 which continually and steadily secreted specific monoclonal antibodies against rVVC are acquired. The type of monoclonal antibody against rVVC is IgG1.

　　Key words: Vibrio vulnificus;cytolysin;vvhA gene;hybridoma;monoclonal antibody

　　创伤弧菌(Vibrio vulnificus，Vv)是一种有荚膜的革兰阴性嗜盐弧菌，主要存在于海水及海产品中，可引起原发性败血症和严重的创口感染[1-2]。近几年，浙江沿海、深圳也时有报道该菌感染病例，已引起很多专家学者关注。创伤弧菌可能包含诸多毒力因子[3]，溶细胞素是其唯一分泌至胞外具有种特异性的膜成孔类外毒素[4]，可作用于多种靶细胞诱导细胞凋亡、坏死，引起细胞炎症反应等[5-6]。此外，体外重组的创伤弧菌溶细胞素(recombinant Vibrio vulnificus cytolysin，rVVC)亦具有典型的细胞毒活性，能引起人ECV304细胞凋亡[7]，诱导人SMMC7721细胞产生细胞应激，上调其TNF-α和HSP90的表达[8]。目前，有关创伤弧菌溶细胞素(Vibrio vulnificus cytolysin，VVC)抗体的研究较少，姚蔚等[9]曾利用体外rVVC制备了其多克隆抗体，并证实该多抗能阻断rVVC对SMMC7721的细胞毒作用，为保护性抗体。而单克隆抗体相比多克隆抗体，具有更高的特异性。因此，本研究中，我们采用Ni2+-NTA亲和层析法纯化原核表达的rVVC，采用杂交瘤技术制备鼠源性rVVC单克隆抗体并进行免疫学鉴定，以期为VVC致病机制的深入研究及创伤弧菌引起的食品污染中溶细胞毒素的快速检测试剂盒研发奠定基础。

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　1.1.1细胞系、菌种及质粒：小鼠骨髓瘤SP2/ 0细胞系购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。E.coli BL21(DE3)pET28a(+)-vvhA由本实验室构建完成及保存。

　　1.1.2实验动物：清洁级雌性6周龄BALB/c小鼠购自中科院上海实验动物中心(上海斯莱克实验动物有限公司)，许可证号：SCXK(沪)2007-0005。

　　1.1.3主要试剂：Ni2+-NTA亲和层析树脂购自上海申能博彩生物科技有限公司。异丙基硫代β-D-半乳糖苷(IPTG)购自宝生物工程(大连)有限公司。还原型谷胱甘肽(GSH)、氧化型谷胱甘肽(GSSH)、盐酸胍及精氨酸购自BBI公司。HRP标记羊抗小鼠IgG、TMB底物显色液购自天根生化科技(北京)有限公司。优级胎牛血清购自杭州四季青生物材料有限公司。RPMI 1640购自Hyclone公司。PEG6000、HT和HAT培养基购自SIGMA公司。PEG2000购自上海生工。

　　1.2方法

　　1.2.1rVVC的表达、纯化及复性：将pET28a(+)-vvhA-E.coli接种于含有卡那霉素(终浓度为25～30μg/mL)的固体培养基中37 ℃孵育，挑取生长菌落至含有卡那霉素(同上)的LB液体培养基37 ℃摇床培养。测菌体浓度，当OD值为0.6～1.0时，加0.5 mmol/L IPTG诱导表达rVVC，振荡培养4 h。11000 r/min离心收集菌体，加入PBS和少量溶菌酶重悬进行超声破碎，11000 r/min离心收集沉淀。沉淀用洗涤液I(2 mol/L尿素、10% Triton-100、20 mmol/L Tris-HCl pH 8.0)、洗涤液II(20 mmol/L Tris-HCl pH 8.0)、洗涤液III(去离子水)分别洗4、3、2次，12000 r/min离心弃上清。用SDS-PAGE检测洗涤效果。将洗涤后的包涵体用复溶液(8 mol/L尿素、1% β-巯基乙醇、100 mmol/L Tris-HCl pH 8.0)充分溶解，12000 r/min离心取上清进行Ni2+-NTA亲合层析纯化。将层析后的收集液放入透析袋中透析，并将透析后的各组分进行SDS-PAGE检测纯化效果。用Broadford法对上述蛋白进行定量后，用550 mmol/L 盐酸胍充分裂解包涵体后，采用李桂军等[10]报道的方法，将复性液缓慢加入到已充分裂解的包涵体中，用复性液(55 mmol/L Tris-HCl、10.56 mmol/L NaCl、0.44 mmol/L KCl、0.55% PEG6000、550 mmol/L盐酸胍、1.1 mmol/L EDTA、440 mmol/L蔗糖、550 mmol/L精氨酸、1 mmol/L GSH、0.1 mmol/L GSSH)进行稀释复性后再经4 ℃三步透析复性。复性后蛋白溶液12000 r/min离心，上清冷冻干燥至干粉，-70 ℃保存。

　　1.2.2免疫BALB/c小鼠和ELISA法检测：纯化复性后rVVC抗原用0.3%～0.4%的甲醛脱毒，4 ℃过夜。初次免疫rVVC与完全弗氏佐剂等量混合乳化，皮下多点注射;20 d后第2次免疫，与弗氏不完全佐剂等量混合乳化，皮下多点注射;之后每隔10 d免疫一次，均与弗氏不完全佐剂等量混合乳化，皮下多点注射。期间断尾采血，ELISA法检测免疫血清效价。达到效果后于融合前3 d腹腔注射不含佐剂的rVVC抗原加强免疫。每次免疫抗原量为10μg。ELISA法测定时，用10μg/mL rVVC包被酶标板，4 ℃过夜。用含0.05% Tween-20的洗涤液洗板后，加入倍比稀释的免疫前与免疫后的小鼠血清(1∶100，1∶200，1∶400，1∶800，1∶1600，1∶3200，1∶6400，1∶12800，1∶25600)，37 ℃孵育1 h，洗板(同上)。加入1∶500稀释的HRP标记羊抗小鼠IgG二抗，37 ℃孵育1 h，洗板(同上)。加底物显色液(TMB)作用20 min左右，用1 mol/L的H2SO4终止其反应，酶标仪(Thermo)测定[11]。

　　1.2.3SP2/0细胞培养：SP2/0细胞培养于含10% FBS的RPMI1640培养基中，37 ℃，5% CO2细胞培养箱(Thermo 3111)中培养。视细胞生长情况进行换液、传代或冻存。融合前SP2/0细胞用含有8-氮杂鸟嘌呤(20μg/mL)、20% FBS的RPMI 1640完全培养液培养1周。

　　1.2.4细胞融合和杂交瘤细胞的选择性培养：颈椎脱臼处死BALB/c小鼠，无菌取脾，注射器法制备脾细胞悬液。脾细胞悬液经1000 r/min 离心5 min后，弃上清。沉淀中加入3 mL 4 ℃预冷的Tris-NH4Cl冰浴5 min使脾细胞中混有的红细胞破裂，加入7 mL RPMI 1640基础培养液终止其作用，1000 r/min离心5 min弃上清，沉淀用5 mL RPMI 1640基础培养液重悬，计数。处于对数期的SP2/0计数后，调整SP2/0与脾细胞的比例，以1:10进行混合，利用37 ℃预热的50% PEG2000，pH 8.0促进其融合。融合后细胞接种于已铺有饲养细胞的96孔板，37 ℃，5% CO2培养箱中培养。融合当天用HAT培养液选择性培养，5 d后观察细胞，视细胞生长状况HAT半换液。2周后换HT培养液培养1周，然后换成20% FBS的RPMI 1640培养液，以后隔天半量换液1次。最后用10% FBS的RPMI 1640培养。待杂交瘤细胞集落长至1/3每孔时，取细胞上清液用ELISA法检测抗体，对其进行初筛，并对阳性克隆孔及时冻存和克隆化培养[12]。

　　1.2.5阳性杂交瘤细胞的克隆化及冻存：对阳性克隆孔细胞计数，调整细胞密度，用有限稀释法对阳性孔进行克隆化[13]培养，每孔细胞数约为0.8个。以SP2/0细胞上清液为阴性对照，间接ELISA法检测孔内细胞上清液。阳性孔重复以上步骤克隆化培养3次。抗体阳性细胞株连续培养期间用ELISA进行检测，并对每次克隆化的阳性克隆孔及时冻存。需冻存细胞用预冷冻存液重悬计数调整细胞密度为2～5×106/mL。分装至冻存管，2 mL/管，做好标记。先置于4℃ 40 min，-20 ℃ 1 h，-70 ℃过夜，最后转至-196 ℃液氮罐保存。

　　1.2.6单克隆抗体免疫球蛋白类型鉴定：取2 mL阳性单克隆杂交瘤细胞培养上清液装入透析袋中，利用PEG6000，4 ℃包埋浓缩至0.2 mL(浓缩10倍)时转至小管中，-20 ℃冻存备用。双向免疫扩散法鉴定分泌的rVVC单克隆抗体类型。中间一孔加10μg/mL的二抗(羊抗鼠IgGl，IgG2a，IgG2b，IgG3，IgA，IgM)，周边加PEG6000浓缩后的上清液，10μL/孔。

　　1.2.7单克隆抗体特异性鉴定：将金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、霍乱弧菌、产气荚膜梭菌超声破碎制备抗原，用包被缓冲液(0.05 mol/L碳酸缓冲液pH 9.6)调节其浓度为50μg/mL，rVVC浓度为5μg/mL，包被酶标板。间接ELISA法测定阳性杂交瘤细胞培养上清的单克隆抗体特异性;同时用双向琼脂扩散法鉴定其特异性，方法1.2.6。中间一孔为抗原(上述五种抗原)，周边孔为浓缩后细胞上清液。

　　1.2.8细胞复苏及抗体分泌稳定性测定：从液氮罐中快速取出冻存管，37 ℃水浴速融，加入10 mL预冷的基础培养液，1000 r/min离心弃上清。加入含10% FBS的RPMI 1640，37 ℃，5% CO2培养箱中培养。第2天时细胞换液继续培养，连续培养3个月。期间每半月用间接ELISA检测杂交瘤细胞分泌状况。

　　2结果

　　2.1rVVC表达及纯化效果经IPTG诱导的pET28a(+)-vvhA大肠杆菌成功表达rVVC，产量约为细菌总蛋白的35%。菌体经超声破碎后离心，沉淀经洗涤液I、II、III洗涤后可得到较纯蛋白(见图1)，再经Ni2+-NTA亲和层析纯化后由Bandscan V5软件分析蛋白纯度，图2中标注8的泳道，目的蛋白纯度可达93%(见图2)。

　　2.2小鼠免疫结果重组溶细胞素包被浓度为10μg/mL，免疫后小鼠血清和免疫前阴性对照血清按1:100，1:200，1:400，1:800，1:1600，1:3200，1:6400，1:12800，1:25600浓度稀释。结果判定，S/N值>2.1均为阳性。ELISA法检测结果(见图3)显示，血清有效稀释度为1:12800。

　　2.3杂交瘤细胞系的选择性培养结果免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合后，经HAT培养基选择性筛选，融合率为31.11%，抗体阳性率为26.20%。经3次亚克隆，ELISA法筛选，得到2株稳定分泌rVVC单克隆抗体的杂交瘤细胞株B2C7与E3F4。图4为不同时间融合细胞生长情况。

　　2.4单克隆抗体免疫球蛋白类别及亚型鉴定根据图5可知，B2C7和E3F4杂交瘤细胞株分泌的rVVC单克隆抗体类型均为IgG1。未见与其他类和亚类的交叉反应，由此可见获得的杂交瘤细胞为具有分泌单一抗体能力的单一细胞系来源的杂交瘤细胞。

　　2.5单克隆抗体特异性检测由间接ELISA法检测(见表1)得出E3F4和B2C7两细胞株分泌的单克隆抗体与rVVC抗原结合较强，几乎不与其他抗原反应，E3F4株细胞分泌的抗体特异性最强。双向琼脂扩散法检测发现，rVVC与细胞上清抗体之间有明显沉淀线，而与其他抗原无明显的反应(见图6)。

　　2.6单克隆抗体分泌稳定性检测由图7可知，获得的2株细胞，在复苏后的90 d经EILSA法检测细胞培养液上清，抗体效价波动幅度不大，具有较稳定的分泌抗体的能力。

　　3讨论

　　创伤弧菌是一种致病性极强的嗜盐性细菌，人一旦感染，短时间内就会引起伤口炎症，严重时会导致败血症的发生。创伤弧菌溶细胞素是其主要毒力因子之一，经VVC注射的实验鼠可出现与创伤弧菌败血症病人类似的临床和病理表现，毫克级水平即可对实验鼠致死。我们利用IPTG诱导pET28a(+)-vvhA的大肠杆菌表达rVVC，经纯化及复性后成功获得有活性的rVVC。在对表达后沉淀(包涵体)进行洗涤时发现，洗涤液(尤其是洗涤液I)洗涤包涵体对蛋白纯化非常重要，可提高Ni2+-NTA亲和层析对rVVC提纯效果。纯化后蛋白经复性后将正确的抗原表位表露出来，使制备的rVVC单克隆抗体能识别溶细胞素的抗原表位。经表达、纯化及复性后得到的rVVC对溶细胞素单克隆抗体制备、致病机制及免疫性研究提供了有利条件。利用基因工程获得rVVC蛋白方法简便，且高效，获得的rVVC的毒性与自然表达的溶细胞素相比毒性较低，再经甲醛脱毒后可在此基础上消除毒性，但保留其免疫原性，可相对增加每次的免疫剂量，从而提高免疫成功率。

　　脱毒后重组溶细胞素抗原与弗氏佐剂等体积混合乳化，佐剂可以减慢抗原的降解，使抗原在免疫部位缓慢、持久释放，从而提高巨噬细胞对抗原的摄取效率，促进抗体的产生，提高免疫效率。诱导免疫小鼠对抗原产生良好的免疫反应，亦即融合所需B细胞群中必须含有能分泌研究所需的特异性抗体的B细胞，而且数量越多、比例越高越好。一般被免疫动物的血清抗体效价越高，融合后细胞产生高效价特异抗体的可能性越大，而且单克隆抗体的质量(如抗体的浓度与亲和力)也与免疫过程中小鼠血清抗体的效价和亲和力密切相关。

　　本实验成功获得rVVC抗体阳性的杂交瘤细胞株B2C7和E3F4株，其可持续稳定分泌rVVC单克隆抗体。B2C7和E3F4株单克隆抗体均为IgG1类，这将有利于标记二抗的选择及建立相应的免疫检测方法。ELISA法检测结果证实，B2C7和E3F4单克隆抗体有较高的特异性，与多种细菌超声破碎抗原无反应。本实验结果为进一步深入研究VVC的致病机制及研发针对创伤弧菌引起的食品污染中溶细胞毒素快速检测的试剂盒具有重要意义。

　　【参考文献】

　　[1] 卢中秋,程俊彦.创伤弧菌感染的流行病学及临床特点[J].中国急救医学,2003,23(5):318-320.

　　[2] Kumamoto KS, Vukich DJ. Clinical infections of Vibriovulnificus: a case report and review of the literature[J]. JEmerg Med,1998,16(1):61-66.

　　[3] 李桂军,楼永良.创伤弧菌细胞素致病机制的研究进展[J].国际检验医学杂志,2006,7(7):633-635.

　　[4] Davi S, Hayat J, Fihsch CE, et al. Capsular polysaccharide-protein conjugate vaccines of carbotype Vibrio vulnificus:construction, immunogenicity and protective efficacy inmurine model[J]. Infect Immun, 1995, 63(8):2906-2911.

　　[5] Kim BS, Kim JS. Vibrio vulnificus cytolysin induceshyperadhesiveness of pulmonary endothelial cells for neu-trophils through endothelial P-selectin: a mechanism forpulmonary damage by Vibrio vulnificus cytolysin[J].Exp MolMed,2002,34(4): 308-312.

　　[6] Kang MK, J hee EC, Koo BS, et al. Induction of nitric oxidesynthase expression by Vibrio vulnificus cytolysin[J].Biochem Biophys Res Commun,2002,290(3):1090-1095.

　　[7] 桂静,肖美英,楼永良,等.创伤弧菌溶细胞素融合蛋白重组、表达与细胞毒活性鉴定[J].细胞生物学杂志,2008,30(1):89-94.

　　[8] 李桂军,桂静,肖美英,等.创伤弧菌溶细胞素vvhA基因在大肠杆菌中的表达及其对应激因子的调控[J].中华微生物学和免疫学杂志,2008,28(1):24-28.

　　[9] 姚蔚,周建娟,李桂军,等.抗重组蛋白rVVC多克隆抗体的制备及其保护作用的鉴定[J],温州医学院学报,2008,38(6):502-506.

　　[10] 李桂军,谢旦立,楼永良.创伤弧菌溶细胞素基因重组蛋白复性条件的优化及活性鉴定[J].温州医学院学报,2007,37(4):320-323.

　　[11] Zhou XL, Zhao H, Gao XD. Preparation and characteriza-tion of monoclonal antibodies against a polysaccharide fromflammulina velutipes mycelium[J].Hybridoma,2008,27(6):439-440.

　　[12] Yang T, Zhong P, Qu L, et al. Preparation and identifica-tion of anti-2,4-dinitrophenyl monoclonal antibodies [J].Immunol Methods,2006,313(1-2):20-28.

　　[13] 徐志凯.实用单克隆技术[M].西安:陕西科学出版社,1992:31-39,65-68.

　　
看了“细胞与克隆技术论文”的人还看：