单克隆抗体技术论文(2)
单克隆抗体技术论文
单克隆抗体技术论文篇二
抗CLCN5单克隆抗体的制备及鉴定
[摘要] 目的：制备抗氯离子通道蛋白5(CLCN5)单克隆抗体(mAb)并对其进行鉴定。方法：用人CLCN5为抗原免疫BLAB/c小鼠，用常规方法进行细胞融合，经筛选及克隆化建立可稳定分泌抗CLCN5 mAb的杂交瘤细胞株;用ELISA及Western blot进行抗体的鉴定。结果：筛选到4株可稳定分泌抗CLCN5 mAb的细胞株;Western blot显示，在4株抗体中有1株在相对分子量为83 kDa处出现1条特异性条带，说明该单克隆抗体可与HSG胞浆蛋白中的CLCN5蛋白特异性地结合。结论：本实验成功获得1株可特异性识别CLCN5的单克隆抗体细胞株，可用于肾结石、X-连锁综合征的进一步研究、临床诊断及相关试剂盒等的开发研制。
[关键词] 氯离子通道蛋白(CLCN5);单克隆抗体;抗体鉴定;细胞融合
[中图分类号] R392-33[文献标识码]A[文章编号]1673-7210(2008)01(a)-014-02
Preparation and identification of the monoclonal antibodies against chloride channel 5
CHEN Li, SHI Zhi-hua
(The Third People’s Hospital of Dalian City, Dalian116000，China)
[Abstract]Objective:To prepare and identify monoclonal antibody against chloride channel 5 (CLCN5) . Methods:We prepared hybridoma cell lines secreting CLCN5 mAb from immunized BALB/c mice with antigen CLCN5, then by cell fusion, screened with indirect ELISA and cloned with limited dilution methods. The properties of antiserum against CLCN5 were characterized by ELISA and Western blot. Results:Four hybridoma cell lines secreting CLCN5 mAb had been developed, and the ELISA titre of the mAbs was respectively detected. According to the Western blot，we could see that the CLCN5 protein was highly expressed with a molecular weight of 83 kDa, it meaned that the monoclonal antibodies specially recognized a protein band expressed in the human submandibular gland(HSG) cell line. Conclusion:We gets a CLCN5 mAb which can be specially recognized by CLCN5. The successful generation monoclonal antibodies protein will provide efficient affinity reagents for the further functional studies of clcn5 gene expressed in human body and it's relation with kidney stone dent's disease and X-linked disorder.
[Key Words] Chloride channel 5; Monoclonal antibody; Identification of the antibodies; Cell fusion
氯离子通道(CLC)是迄今发现的唯一电压门控氯离子通道，在细胞兴奋性调节、细胞容积调节和跨上皮物质转运等生理过程的调节中发挥重要作用。氯离子通道蛋白5(chloride channel 5, CLCN5)是其众多分类中的一类，在核内体上参与肾脏细胞的胞饮作用，分子量为83.152 kDa。氯离子通道蛋白基因5(clcn5)有13个外显子，位于X染色体短臂(Xp11.22)，在肾脏、血管、胰腺、胎盘中均有表达，但以肾脏为主。在西方国家，12%的男性和5%的女性被肾结石疾病困扰，45%的病人有家庭史，且通常与高钙尿相关，异常高钙尿性肾结石(DENT’S 病)，X-连锁隐性肾结石(X-linked recessive nephrolithiasis，XRN)，X-连锁隐性低磷性佝偻病(X-linked recessive hypophesphatemic nickets，XLRH)都在Xp11.22上表示，这个位置正是clcn5基因的特有位置。调查11个有CLCN5异常的血缘家族后，Lloyd SE等报道，在异型卵母细胞上野生型clcn5的异种表达能纠正外流的氯离子通道，但突变后则可以完全废除或明显减少，所以CLCN5可能参与了因肾小管功能异常而引起的肾结石形成。本实验通过细胞融合制备出抗CLCN5抗体后通过ELISA、Western blot 等方法对抗体进行验证，对于今后对CLCN5 的继续研究和因其突变引起的疾病的病因和治疗方法等的研究提供了初步的帮助。
1 材料和方法
1.1材料
1.1.1实验动物和细胞人颌下腺细胞系HSG、小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0为本实验室保存，融合用的脾细胞及骨髓瘤细胞均由本实验室制备及培养。实验用小鼠系BALB/c 小鼠为军事医学科学院动物中心提供。
1.1.2主要试剂含抗CLCN5单克隆抗体的细胞上清均为本实验室制备。新生牛血清(杭州四季青生物工程材料公司)，弗氏佐剂(美国Sigma 公司)，HRP-羊抗鼠IgG(广州中杉生物有限公司)，96、24、6孔板与10 ml和50 ml的灭菌沉淀管或瓶(BECTON DICKNSON公司)，ECL显色试剂盒(Amersham公司)，PVDF膜、医用X-胶片、滤纸(KODARK公司)。其他试剂均为本实验室参照《分子克隆》第三版自配。
1.1.3仪器37℃恒温水浴箱(北京精科华瑞仪器有限公司)，酒精灯、离心机(瑞江分析仪器有限公司)，酶联检测仪(BIO-RAD公司)，洗板机(北京拓普分析仪器有限公司)，酶标板、系列移液器(Eppendorf 公司)，恒压或恒流电源、垂直板电泳槽和制胶模具、电泳仪、转膜仪(BIO-RAD公司)。
1.2 mAb制备方法
1.2.1免疫动物初次免疫用纯化的CLCN5/GST融合蛋白，用生理盐水稀释后与等体积弗氏完全佐剂混匀搅拌乳化后，BALB/c小鼠皮下免疫两点，其余腹腔注射。4周后用同样剂量的抗原与不完全佐剂混匀进行二次免疫，方法同首次免疫，7 d后ELISA测血清效价决定是否三免，于融合前3天再用同等剂量的抗原腹腔注射，加强免疫1次。
1.2.2杂交瘤细胞株的建立细胞融合、筛选及克隆化。取加强免疫后小鼠，眼眶采血后处死，酒精消毒后平皿中取脾，转移至50 ml离心管中，加RPMI 1640至30 ml稀释后取1×108 个细胞备用。取SP2/0细胞1×107个与之前的脾细胞混合离心，1 500~2 000 r/min离心5 min，弃上清，将沉淀弹成糊状，37℃水浴，1 min内加入1 ml PEG并搅拌，37℃水浴放置1 min。分别在1、2、3 min内加入1、4、15 ml RPMI 1640终止融合，800 r/min离心7 min。弃上清弹匀细胞，加入HAT培养液，混匀后，滴入96孔板，放入CO2培养箱中，并定时换液，同时用CLCN5/GST融合蛋白和GST蛋白做包被抗原，采用间接ELISA筛选细胞培养上清，阳性克隆以有限稀释法克隆化。
1.3 抗 CLCN5 mAb的特性鉴定
1.3.1抗CLCN5抗血清效价测定应用ELISA的方法对免疫后的融合鼠血清进行效价测定。
1.3.2 ELISA筛选采用酶联免疫吸附试验测定抗体效价。首先用纯化的抗原蛋白包被96孔酶联板，4℃过液或37℃ 2 h，洗液洗涤3次，加封闭液4℃过液或37℃2 h后洗3次，拍干，4℃保存。将融合细胞上清加样到包被好的酶标板上，每板取无细胞生长的2孔为阴性对照，再选无细胞生长的2孔加阳性血清，作为阳性对照，37℃孵育30 min洗板4次，拍干，加入1∶5 000稀释的酶标二抗37℃孵育30 min，洗板4次，拍干。37℃ DAB显色15~30 min，加终止液，450 nm测定OD值。
1.3.3Western blot鉴定mAb 的特异性SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳：将样品与样品缓冲液按3∶1的比例混匀，100℃水浴加热3～5 min。按《分子克隆》制备分离胶和浓缩胶溶液，待浓缩胶溶液聚合后小心拔出样品梳，将样品孔中依次加入Marker、HSG胞浆蛋白、CLCN5蛋白和含GST标签蛋白各8、3、10 、10 μl。在恒压80 V条件下开始电泳，至样品溶液进入分离胶后将电压调至180 V，直至电泳结束。免疫印迹法检测抗体的反应性和特异性：取出凝胶，切去凝胶边缘，浸于TF缓冲液30 min。另取与凝胶同样大小的厚滤纸2张，硝酸纤维素膜(PVDF膜)1张，用TF缓冲液浸透。用半干胶转移仪进行转移。在电极板上依次放上湿厚滤纸1张，硝酸纤维素膜1张，电泳凝胶，湿滤纸3张，盖上电极板，按0.8 mA/cm2硝酸纤维素膜，恒电压18 V转移30 min。取出硝酸纤维素膜浸入封闭液37℃封闭60 min，弃去液体。加入6 ml适量的供试品抗体溶液，4℃反应过夜。硝酸纤维素膜用TBST 缓冲液洗1次，再用TBST 缓冲液浸洗3次，每次8 min。弃去液体，再加入10 ml适量的HRP或AP标记的二抗，37℃摇动反应40 min。硝酸纤维素膜用TBST缓冲液洗1次，再用TTBS 缓冲液浸洗4次，每次8 min。弃去液体，加入混合好的ECL显色液 (1 ml/张膜)，在暗室进行曝光显影。阳性结果应呈现明显曝光带，阴性结果没有曝光带。
2结果
2.1血清效价测定情况
CLCN5抗原免疫BALB/c小鼠抗体血清效价测定结果见图1。
图1CLCN5抗原免疫BALB/c小鼠抗体血清效价测定
1/8 192 000为阴性对照
2.2 杂交瘤细胞株的建立
以CLCN5为免疫原、经免疫动物、细胞融合及克隆化建立了4株能稳定分泌抗人CLCN5单克隆抗体的杂交瘤细胞。细胞株分别命名为：AF111、BAE094、BAE102、BBE065，经ELISA检测此4株细胞上清均为阳性，见表1。
2.3单克隆抗体的鉴定
图2为HSG蛋白的SDS�PAGE。由图3可知Western blot的结果，4株抗体中只有BAE102细胞株分泌的抗体在预期的位置83 kDa附近有一条特异性条带，GST-CLCN5 融合蛋白在32 kDa处有一阳性条带。
3讨论
实验中前两次Western blot均失败，第一次显影无特异性条带，且染膜后Marker无条带显示，初步怀疑转膜失败、Marker上样量不足导致，第二次背景过深且条带不清可能是由于二抗浓度过高导致，故第三次增加了Marker上样量并将二抗以1∶7 500的比例稀释实验成功，Western blot所有加入纯抗原蛋白的孔都无特异性条带出现，其SDS-PAGE 也没有任何蛋白条带，所以初步怀疑抗原浓度不足或此抗原无效。
氯离子通道在细胞兴奋性调节，跨上皮物质转运，细胞容积调节和细胞器酸化作用等过程中发挥重要作用[1,2]。这种功能的多样性对应于由不同基因编码的不同种类的氯离子通道。目前在哺乳动物细胞中已经克隆得到了9种不同的CLC通道[3]。而且,在植物、酵母和细菌中也发现了这种通道蛋白。有些CLC通道的功能缺失或改变与人类的某些遗传性疾病有密切的关系，如先天性肌强直、肾结石和bartter’s综合征。1974年Buckalew VW 报道一家族4代成员中均有以蛋白尿、高钙尿肾结石或肾钙质沉积、肾小管酸中毒为表现的遗传性综合征，当时该病被认为是遗传性肾小管酸中毒。但随着基因定位技术的发展，发现患者都存在X染色体短臂上clcn5基因的突变，由于该基因编码了肾小管上的一种电压控制的氯离子通道CLCN5，突变引起组成CLCN5蛋白的氨基酸丢失，通道功能丧失，因此这类疾病被称为X-连锁综合征，临床可分为4种类型，即X-连锁隐性肾结石(X-linked recessive nephrolithiasis，XRN)、DENT’S病(DENT’S disease)、X-连锁隐性低磷性佝偻病(X-linked recessive hypophesphatemic nickets，XLRH)、日本儿童特发性低分子量蛋白尿[4~8]。对本抗原的进一步研究及对其相应抗体的鉴定有助于肾结石病因的探索和寻找适合的治疗方法。而制备CLCN5抗体的研究在未来可分别应用于以下两个方面[9，10]：①研究与CLCN5分子相互作用的分子;②Western blot分析、筛选表达CLCN5分子的细胞和组织。本试验制备的鼠抗CLCN5抗血清为进一步研究该分子的生物学功能及其在其他组织中的作用提供了必要的工具，对CLCN5的初步研究与相应抗体的制备及鉴定不仅对与其他CLC通道蛋白的研究及其抗体制备奠定了基础，并对肾结石和X-连锁综合征的临床诊断和治疗提供了重要的制剂。
我们免疫小鼠并通过细胞融合制备了抗CLCN5的细胞上清，并通过ELISA、Western blot 等方法进行了其特异性分析，实验结果显示，细胞上清中产生了抗CLCN5抗体，在4株抗体中只有BAE102抗体对CLCN5蛋白的ELISA呈阳性，对GST融合蛋白的Western blot呈阳性，说明这些抗体可特异性识别重组表达及细胞中表达的CLCN5，并可特异性识别天然状态下的CLCN5，其对CLCN5具有很好识别特性。
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