分子印迹技术论文(2)
分子印迹技术论文篇二
生物大分子印迹传感器研究进展
摘 要 分子印迹传感器在有机小分子分析检测方面的应用已趋近成熟，在生物大分子检测方面的应用近年来也逐渐增多。本文就近年来分子印迹技术在大分子生物传感器中的构建及应用进行综述，包括光学传感器、电化学传感器、质量型传感器等，并对目前分子印迹传感器在生物大分子检测方面存在的问题进行分析，对生物大分子印迹传感器的未来发展方向提出展望。
关键词 分子印迹传感器; 生物大分子; 综述
1 引 言
1.1 分子印迹技术
1.1.1 分子印迹的发展 分子印迹起源于20世纪30年代，Polyakov[1]和Dicky[2]首次提出了特异性吸附的硅胶，研究其对甲基橙和乙基橙的特异性吸附能力。此后，研究者一直局限于“抗原-抗体”相互作用的思维。直到1972年，Wulff等[3]提出了“分子印迹(Molecular imprinting)”的概念，成功制备了具有对D-甘油酸对映选择性的分子印迹聚合物，使分子印迹技术取得了突破性的进展。1993年Vlatakis 等[4]在《Nature》上发表了关于茶碱分子印迹聚合物的研究，对分子印迹具有的特异性识别能力进行了第一次系统性的描述，形象地将分子印迹聚合物称为“塑料抗体”[5]。该文章的发表直接促进了分子印迹技术在近20年内的飞速发展。目前，分子印迹技术已在材料学[6]、分析化学[7]、生物化学[8，9]、生物医药[10]学科领域广泛应用。然而，分子印迹在蛋白质乃至生物大分子方面的应用仍然是最具有挑战性的课题之一。1985年，Glad等[11]利用有机硅烷单体制备了蛋白质分子印迹聚合物，在高效液相色谱中表现出对糖蛋白的亲和性。由于生物大分子尺寸巨大、构象复杂，分子印迹技术在生物大分子的应用进展缓慢。直到表面分子印迹技术[12]及抗原决定簇[13]印迹方法的兴起，生物大分子印迹渐渐成为了分子印迹研究的热点。本文主要就分子印迹技术在生物大分子传感器中的应用进展进行综述。
1.1.2 分子印迹技术基本原理 分子印迹技术主要原理[14]是将功能单体、模板分子以交联剂或者电聚合的方式通过特殊的作用力相结合制备出分子印迹聚合物，而后通过一定的溶剂或者其它方式洗脱除去模板分子留下与模板分子大小、形状、空间构型都互补的孔穴，从而具有对模板分子进行特异性识别的能力。构成分子印迹技术的基本要素有： (1)功能单体 与模板分子形成识别位点;(2)交联剂 将功 能单体与模板分子固定下来形成具有一定空间构象的高聚物;(3)引发剂 通常分子印迹有化学聚合和电聚合两种方式，在化学聚合中需要特定的引发方式如光、电、热、化学物质等将已连接单体的模板分子通过交联剂形成分子印迹聚合物;(4)洗脱剂 对已聚合的物质进行洗脱处理，从而形成对目标物质具有特异性识别能力的孔穴。
基于功能单体与模板分子之间的相互作用力的不同，研究者提出了3种聚合物结合方式： (1)由Wulff等[3]提出的预组装法，功能单体与模板分子间以可逆的共价键相结合，通过打断共价键的方式去除模板分子，由于共价键较为稳定，其所形成的分子印迹聚合物也较稳定，印迹孔穴的结合位点较为均一，但同时也导致了洗脱过程和响应时间较长。(2)Vlatakis 等 [4]提出了以“非共价作用”自组装模板分子，主要以氢键、范德华力、π键等弱作用力将单体与模板分子相结合，降低了模板分子洗脱的难度，加快了响应时间。(3)1995年，Whitcombe等[15]结合了共价作用和非共价作用，提出了“半共价法”，在聚合过程中用共价键的形式结合，而通过非共价作用进行特异性识别，提高了分子印迹聚合物的稳定性的同时，加快了印迹识别的响应时间，成功制备了胆固醇分子印迹聚合物。
1.1.3 分子印迹技术特点与应用 分子印迹技术具有显著的特点： (1)构象预定性 分子印迹聚合物中的模板分子是预先设定的，根据模板分子的不同，可以选择不同的单体进行分子印迹聚合物的制备。(2)识别特异性 模板分子在经过单体、交联剂的共同作用下形成刚性空间结构，在洗脱模板分子后，聚合物空腔中依然存在与模板分子特异性结合的位点，从而达到类似于抗原-抗体的相互作用机制。(3)环境耐受性 聚合物具有的刚性结构决定了它具有优良的环境耐受性，耐酸碱、耐高温、抗恶劣环境等。(4)使用寿命长 可重复使用、造价低廉和稳定性高。这些特点为分子印迹材料在仿生传感器[16，17]、靶细胞给药[18]、模拟酶[19，20]、固相萃取[21，22]等领域的应用奠定了坚实的基础。但分子印迹技术应用的模板多数为有机物[23～27]、金属离子配合物[28，29]等小分子化合物，而对生物大分子如蛋白质、DNA、病毒等的应用总体处于研究的初期阶段。因此，有必要对分子印迹在生物大分子中的应用进行总结，从而寻求更大的突破。
1.2 生物大分子及印迹技术
生物大分子指的是作为生物体内主要活性成分的各种分子量达到上万或更多的有机分子。生物大分子大多数是由简单的生物单分子聚合而成的，蛋白质的组成单位是氨基酸，核酸的组成单位是核苷酸等，它们是构成大分子的基本物质[30]。蛋白质、核酸和多糖是3类主要的生物大分子，它们在分子结构和生理功能上差别很大，然而，在以下几个方面又显示出共性： (1)在活细胞内，生物大分子和相应的生物小分子之间的互变，通常通过脱水缩合，或加水分解。蛋白质链(或称肽链)、核酸链和糖链都有方向性，尽管方向性的体现各不相同。(2)蛋白质、核酸和多糖分子都有各具特征的高级结构，正确的高级结构是生物大分子执行其生物功能的必要前提。(3)在活细胞中，三类生物大分子密切配合，共同参与生命过程，很多情况下形成生命活动必不可少的复合大分子，如核蛋白、糖蛋白。随着生物医学，蛋白质组学的快速发展，对蛋白质等生物大分子的检测也受到了极大的关注，建立快速、简单、特异性强、高通量的生物大分子检测方法已经成为分析科学的研究重点之一。从1991年Dhal等[31]利用Cu2+的配位作用，制备了对咪唑化合物进行分子识别的表面分子印迹聚合物至今，将分子印迹技术应用于蛋白质[16，32，33]、DNA[34～37]、细胞[38，39]、病毒[40，41]等生物大分子检测识别的研究一直是分子印迹应用的主要方向之一。据Web of Science统计，相关的年发表文献量由1996年的10余篇增加到2014年的100余篇。 与小分子印迹技术相比，大分子印迹技术存在更大的困难和挑战。首先，模板分子的洗脱及识别困难是大分子印迹技术面临的最主要问题。目前报道中，强酸、强碱、乙醇、PBS缓冲是常规印迹技术中洗脱的常用手段，而在蛋白质等大分子印迹中，因尺寸较大，洗脱效果一直存在效率过低的问题[8]。此外，高度交联的网络结构还导致了目标分子扩散受到限制，从而结合能力低，平衡时间较长。表面分子印迹技术是目前解决模板分子传质阻力较大的主要方法，例如印迹纳米丝或印迹纳米微球等[33，42，43]。在此基础上，利用蛋白酶的降解作用来洗脱模板蛋白受到蛋白分子印迹研究者的重视[44]，Moreira等[32]在酰胺化的金电极表面先固定肌红蛋白，采用丙烯酰胺类功能单体，N，N-亚甲基双丙烯酰胺作交联剂在电极表面自组装分子印迹层，然后用蛋白酶K消解除去模板肌红蛋白。以铁氰化钾为离子探针，采用方波伏安法(SWV)测量，检出限达0.28 μg/mL，其原理如图1。
Wang等[45]在玻璃基质表面利用硼酸亲和作用先共价结合模板糖蛋白，通过自聚合多巴胺和间氨基苯硼酸形成亲和力导向可控的表面分子印迹聚合物，在高pH环境中显示高效的硼酸亲和作用，在酸性环境中呈现较低的亲和作用。以辣根过氧化氢酶(HRP)为例，当pH=9.0时解离常数Kd=6.6×10 9，pH=3.0时， Kd=2.7×10 7，且在pH调整中并不影响分子印迹的特异性识别能力，表现出良好的选择性。其原理如图2。
此外，用于制备MIP的介质种类有限。在有机相中制备MIP已经日渐成熟，而以水溶液为介质的制备研究却较少，而生物分子酶、蛋白质等生物活性物质通常在水环境中较稳定。研究水相中生物大分子印迹膜的合成方法是一个重要方向。最后，生物大分子印迹识别的机理还没有得到较为完整且系统的理论，大分子结构的复杂性和印迹聚合物作用力的多样性都成为其机理研究主要困难，只有解决了这个问题才会使大分子印迹传感器得到进一步的发展。
2 生物大分子的分子印迹方法
将分子印迹技术应用到蛋白质等大分子至今，其印迹方法可以分为： (1)整体印迹[46～48](Bulk imprinting)，整体印迹又称为包埋法，主要特征是模板分子大都聚合在印迹物内部，在印迹过程中由于传质阻力的增大存在再识别的效率不高，聚合物有效尺寸过低等问题。常用的聚合方法有本体聚合、悬浮聚合、乳液聚合和沉淀聚合等。(2)表面印迹法 (Surface imprinting)， 区别于整体印迹技术的三维印迹，表面分子印迹是指在载体或者基质表面制备分子印迹聚合物，由于其识别位点位于载体或者基质的表面，在一定程度上降低了印迹孔穴洗脱和再识别的传质阻力，特别适合于蛋白质等生物大分子的分离检测。表面印迹的方式主要有电聚合[49]、印迹微球[50]、印迹纳米粒子[33，51，52]等。(3)抗原决定基法[13，53，54](Epitope approach)又名“子结构”印迹方法[55]，受抗原-抗体相互通过一小段活性位点进行识别的启发，近年来，研究者在蛋白质分子印迹中，将一小段暴露的蛋白多肽序列作为模板分子进行印迹，得到的聚合物不仅能识别这一段多肽序列，更能进一步的识别整个蛋白质大分子，从而避免了由于蛋白尺寸过大导致的识别效率过低、传质阻力过大等困难，同时，小段多肽聚合物材料具有更优良的特异性识别作用，近年受到越来越多的研究者的关注。
3 大分子印迹传感器
受益于分子印迹聚合物类似于生物识别系统(抗原-抗体、酶-底物、激素-受体等)的高选择特异性，且具有比生物识别材料更好的环境耐受性、更低的制作成本、更好的稳定性。生物传感器的敏感元件使用的酶、激素等生物敏感材料对适用条件和环境的苛刻要求，极大地限制了其发展。分子印迹技术不仅拥有生物传感器的高识别能力，同时具有生物敏感材料所缺少的高稳定性的特点，因而分子印迹传感器是生物传感器的理想发展方向之一。随着分子印迹聚合物的模板分子不只是局限于小分子印迹，将分子印迹应用于传感器方向将有更为广阔的应用前景，例如制作一些具有免疫抑制性的人工抗体。
分子印迹聚合物的合成是分子印迹研究的关键步骤，当洗脱完成后MIPs与模板分子结合，产生物理或者化学信号，转换器(压电晶体、电极、电阻等)将信号转换为可定量输出的检测信号，通过检测信号实现对待测物质的检测，这就是一个传感的过程，根据转换信号的不同，可以大致的分为光学传感器、电化学传感器、质量型传感器。
3.1 光学型印迹传感器
光学传感与分子印迹联用通常有荧光[56]、发光[57]和表面等离子共振[58](SPR)型。光学传感具有的高灵敏度，分子印迹光学传感的检出限在小分子检测中通常能达到ng级，因此，人们正在积极探索将其应用于痕量大分子检测的可能性。Sunayama等[59]合成了一种由甲基丙烯酰基、仲胺基、苯甲酸基三种功能团构成的单体，在改性的玻璃基质上制备了溶菌酶分子印迹膜，在移除溶菌酶分子后，在MIP仲胺基上引入荧光染料，只有当靶蛋白与分子印迹膜重新结合后，才能产生荧光信号，通过荧光信号的差异检测目标蛋白，测定结果可与SPR相媲美。采用类似的策略，Sunayama等[60]合成了一种新的功能单体MDTA，将蛋白识别信号转换为荧光信号，其检测原理如图3。Liu等[61]用磁性纳米粒子来进行MIP表面印迹物的分离，用荧光探针检测信号，建立了对目标酶蛋白的选择性检测的新方法。其在Fe3O4磁性纳米粒子表面印迹了对DNase I具有特异选择性的聚合纳米材料，通过外加磁场分离出目标酶蛋白聚合物，进而洗脱出DNase I，用荧光探针进行酶含量的检测。
3.2 分子印迹电化学传感器
分子印迹电化学传感器(MIECSs)是目前最为成熟、应用最为广泛的传感器体系，根据响应信号的不同可以分为电流(安培和伏安)、电位、电导、电容(阻抗)、场效应等类型。其中报道最多的传感器主要是电流型和电容型，它们的主要区别是MIPs与模板分子进行重吸附后产生的检测信号的不同。分子印迹电化学传感器的印迹敏感膜制备方法大致有电聚合法、滴涂法、原位引发聚合以及自组装法。电聚合法是使用最为广泛且较为成熟的聚合膜制备方法，通常可以分为恒电位法、恒电流法以及循环伏安法。循环伏安法可通过对电化学参数及扫描圈数来控制成膜的厚度，重现性良好且操作较为简便而应用广泛。电聚合采用的功能单体有导电型和非导电型。在大分子印迹领域，还对单体的生物相容性提出了要求。导电型印迹膜单体通常有吡咯、苯胺等，非导电型单体主要采用邻苯二胺、对氨基苯硫酚、苯酚等。 3.2.1 电容(阻抗)型传感器
电容型分子印迹传感器依据的是以印迹膜选择性识别目标分子前后电容或阻抗的变化作为检测信号，其优点是不需要外加试剂或者探针，可以提供实时信号，特别适用于一些非电活性物质的检测。
Cai等[16]在玻璃基板上生长碳纳米管阵列，嵌入SU8-2002聚合材料，以苯酚为单体，构建了人体铁蛋白的阻抗型电化学传感器，检测的线性范围达到1×10 12 ～ 1×10 7 g/L，其原理见图4。Zhang等[62]用溶胶-凝胶及自组装技术在Au电极表面聚合了人血清白蛋白，运用压电石英晶体阻抗技术及电化学阻抗技术，以铁氰化钾为探针分子，对人血清白蛋白进行了定量检测，检出限为10 6 mg/mL。
3.2.2 电流型传感器 电流型分子印迹传感器是目前电化学传感器应用最多的类型，以识别前后电流变化作为响应信号，既可以直接检测电活性印迹分子的氧化-还原电流，也能通过底物探针如铁氰化钾[63]对非电活性物质进行间接测定。常规的电流型分子印迹传感器灵敏度不高，特别是在大分子如蛋白质检测方面。如何提高传感器的灵敏度是目前重要的研究方向。纳米材料为该问题的解决提供了一个有力的工具[64]。Wang等[49]在石墨烯改性玻碳电极上修饰离子液体，用电聚合吡咯的方法制备了牛血红蛋白分子印迹电极(图5)，用铁氰化钾为离子探针，采用DPV法测定目标蛋白在电极上印迹前后的电流变化值实现对BHb的测定，检出限达30 pg/L。实践证明，纳米材料在印迹传感器信号放大中有广阔的应用前景[65～70]。
3.2.3 电位型传感器 分子印迹电位型传感器采用的响应信号是分子识别前后电极电位的变化，识别过程中探针或模板分子不需要扩散穿过印迹膜，降低了信号响应时间。Wang等[71]通过在Au涂层表面自组装多羟基硫醇单分子膜建立对肌红蛋白和血红蛋白的电位型分子印迹传感器，传感器表现出了对目标蛋白的优异选择性。Moreira等[72]采用了类似的方法在硅珠表面自组装有机硅烷的单分子膜构建了肌红蛋白的电位型传感器。
3.3 质量型传感器
分子印迹质量型传感器主要包括压电石英晶体微天平型[73，74](QCM)及表面声波传感器型(SAW)。其中较为常用的是QCM型，它是在石英晶体电极表面固定识别元件，通过印迹识别前后振幅、频率等的变化得到目标分子质量及浓度信息来达到检测目标分子的目的。而SAW与QCM的区别是共振频率更高，具有更高的灵敏度。Rick等[75]用溶菌酶和细胞色素C混合蛋白作为模板分子，采用间氨基苯硼酸(APBA)作为功能单体，在过硫酸铵的引发下，将聚合的印迹物涂覆在QCM金电极表面，通过比较识别前后的频率变化来对物质浓度进行检测。结论显示出此聚合物电极具有特异性识别混合蛋白的能力，对模板蛋白的检出限低至1.39 × 10 9 mol/L(图6)。Reddy等[76]合成了以牛血红蛋白和胰岛素为模板，采用丙烯酰胺类功能单体，制备了亲水型分子印迹水凝胶，利用QCM对目标蛋白进行检测。文章同时考察了四种丙烯酰胺类功能单体的特异性结合能力，通过计算印迹膜与非印迹膜的识别位点数比值α确定在最佳条件下丙烯酰胺功能单体具有最佳的特异性吸附能力。
3.4 在分子成像中的应用
分子成像是近年来将分子生物学与成像技术相结合的新领域，它具有可视化、动态采集、全面反映等特点。随着原子力显微镜、分子成像技术等的逐渐普及和分子造影技术的长足发展，分子印迹技术也逐步用于分子成像可视化分析[77]。此外，分子印迹-分子成像技术近年来也不再局限于界面表征，Alessandro等[78]用纳米二氧化硅作为载体材料，有机硅烷作为功能单体，利用表面印迹的方法和分子成像技术对番茄丛矮病毒和芜菁黄花叶病毒的印迹行为进行识别和分析。随着高分辨率及高通量电子显微镜的普及，印迹技术在分子成像中的应用将会更加广泛，病毒、细菌等生物活体的在线监测也将具有良好的研究前景。
4 生物大分子分子印迹传感器的展望
分子印迹技术利用仿生原理进行分子识别，它具有的高度特异性和对生物活性物的高亲和性及良好的稳定性都为其在生物大分子的分析应用奠定了基础。随着生命分析科学的发展，大分子印迹技术将不再局限于蛋白质、DNA等的识别检测，细胞、细菌乃至病毒等带有生命体征的“模板”将会是分析工作的下一个重点。其次，新材料的应用，例如石墨烯、MOF材料、C60等的应用对提高大分子分析检测的灵敏度和稳定性有巨大的潜力。最后，印迹传感器的微型和便携化，例如芯片实验室等，同样是分析工作的重要领域。传感器的微型化优势不仅仅表现在野外现场检测，在大规模的传染性疾病的临床检测中，同样具有广阔的应用前景。
Refferences
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