脆性X智力低下基因有什么研究
检测脆性X染色体综合征智力低下基因FMR1中(CGG)n拷贝数的多态性。下面小编为你整理脆性X智力低下基因FMR1中不稳定DNA序列的研究，希望能帮到你。
【摘要】 目的 检测脆性X染色体综合征智力低下基因FMR1中(CGG)n拷贝数的多态性。 方法 采用PCR结合序列胶银染法、Southern blot杂交分析法，对299条表型正常的湖南省人群X染色体FRAXA位点(CGG)n拷贝数的多态性及分布频率进行了测定和验证。 结果 显示其范围为20～40，高峰为28，PCR-序列分析银染法结果与Southern blot法结果完全一致。 结论 检测了湖南省人群X染色体FRAXA位点(CGG)n拷贝数的多态性;运用PCR-序列分析胶银染法快速、直接、简便、实用，适合脆性X综合征的大规模群体筛查。
【关键词】 脆性X综合征 FMR1 (CGG)n PCR
脆性X综合征(fragile X syndrome，FraX)是常见的遗传性智力低下性疾病之一，其发病率仅次于唐氏综合征。在人群中男性的发病率约为1/4000 [1] ，女性的发病率为1/2500 [2] 。其在细胞学上主要表现为Xq27.3带处有一细丝样的脆性位点(FRAXA) [3] ，在分子水平上表现为FMR1基因5'端(CGG)n的异常扩增。(CGG)n在正常人群体中呈多态性，n=6-50，当n=50-200时为前突变，n>200时为全突变，同时伴随其周围CpG岛异常甲基化 [4] 。我们根据FraX基因致病特点，通过测定湖南省人群中CGG重复序列，了解其分布的多态性，并建立一个简便、快捷的基因检测方法。
1 材料和方法
1.1 研究对象及标本 208名人群为本校附属医院门诊自愿受检者，男117名，女91名，年龄24～56岁，平均36.5岁。分别从肘静脉抽取血1～2ml，以草酸钾抗凝，标本按碘化钾法提取DNA。
1.2 主要试剂 T 4 多聚核苷酸激酶、PBR322/MSPI、7-deaza-dGTP等均为NEB公司产品，杂交液、尼龙膜、PCR扩增相关试剂均购自上海生工，探针PE5.1由美国纽约州立发育不全基础研究所Nanbert Zhong博士惠赠。
1.3 PCR扩增 PCR引物设计参照文献 [5] ，在FMR1基因内(CGG)n重复区域两侧合成引物。其中上游引物为:5'-GGAACAGCGTTGATCACGTGACGTGGTTTC-3'，下游引物为:5'-GTGGGCTGCGGGCGCTCGAGG-3'。反应体积为20μl，其中包括10×PCR缓冲液，50～100ng模板，每种引物5pmol，200μmol/LdNTP，其中dGTP中75%为7-deaza-dGTP，10%DMSO，1UTaq DNA聚合酶。反应程序为:95℃预变性5min，95℃1min，65℃1min，72℃2min，进行30个循环，最后72℃延伸10min。
1.4 PCR产物的序列胶银染法检测 取10μl PCR产物加入载样缓冲液于6%序列胶电泳。电泳毕经乙酸固定、Ag-NO3溶液染色及Na 2 CO 3 显示后观察结果。
1.5 Southern印迹杂交 取5μl PCR产物于6%序列胶电泳，常规电转膜，用5′末端标记法以γ- 32 P-ATP标记探针PE5.1，经预杂交4h，杂交2h，充分洗膜后常规压片，-70℃放射自显影。
2 结果
2.1 湖南省人群中FRAXA位点(CGG)n的多态性及分布频率用PCR方法分析了299条X染色体。经序列胶测定(图2)，Southern印迹杂交法验证(图3)，表明(CGG)n的拷贝数在20～40之间(见表1)，频率最高的为28(图1)。
表1 湖南省人群中299条X染色体的CGG重复数 CGG重复数 等位基因数 构成比(略)
图1 299条X染色体的(CGG) n 多态性分布图 2.2 6%序列胶电泳检测PCR产物 见图2。
2.3 Southern blot检测PCR产物 Southern印迹杂交结果显示PCR扩增产物区带所在位置与图2完全一致(见图3)。
3 讨论
3.1 湖南省人群中FRAXA位点(CGG)n的多态性 299条M:PBR322/MSPI;1，2，3，4，5，6分别表示CGG重复数为28，28，31，28，28，29第1，6道为正常女性，第2，3，4，5道为正常 男性(下同)。
图2 6%序列胶电泳
图3 Southern印迹杂交
表型正常的湖南省人群X染色体FRAXA位点(CGG)n测定结果显示，其拷贝数范围为20～40，高峰为28，占被检总数的64.88%。Hofstee [6] 等报道的(CGG)n峰值为28，Jacobs [7] 等研究发现有2个高峰，即:19～23和28～31。本文结果与文献报道基本相符，但未见到明显的终端重复数，说明选取样本有限。
3.2 PCR-序列分析胶银染法的运用 目前已有多种筛查及诊断FraX的方法，但不同方法各有其局限性。如细胞遗传学分析虽可以直接观察染色体脆性位点的病变，但此方法检出率较低;DNA连锁分析较细胞遗传学分析增加了可信度，但该技术需要有先证者，致使检测受到一定程度的限制;经典的Southern blot法虽然准确性很高，但需要用同位素来标记，给操作者带来了一定的危害，并且操作繁杂，费用昂贵，耗时长;常规的PCR法虽简便，但因无法打开CG含量高的DNA模板导致扩增失败。因此，探索出一个稳定、快速、适合大规模人群筛查FraX的方法具有重要的意义。我们通过用7-deaza-dGTP代替dGTP的改良以降低Tm值，对299条X染色体的FRAXA位点(CGG)n进行了扩增，取得了较好的效果。检测结果显示湖南省人群的高峰为28，而且PCR序列胶银染法与PCR-Southern blot法结果完全一致。因此。该方法对FRAXA的大量群体筛查具有重要的意义。
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