克隆生物技术论文(2)
克隆生物技术论文篇二
丹参SmNAC1基因的克隆和生物信息学分析
[摘要] 为了研究丹参中特有的NAC转录子在丹参生长发育、激素调节和抗逆胁迫应答调节中的功能，对丹参NAC转录因子进行了克隆和分析。根据丹参毛状根cDNA文库中筛选到的NAC EST序列，克隆了丹参SmNAC1的cDNA全长序列。生物信息学分析显示基因的开放阅读框591 bp，编码166个氨基酸，相对分子质量21.66 kDa，等电点4.36 Genbank kF006346。SmNAC1蛋白的N-端具有保守的NAC_AB结构域，C-端高度变异。根据软件预测SmNAC1可能定位在细胞核。qRT-PCR分析YE+Ag+处理后SmNAC1在丹参毛状根中的表达变化，处理后2 h表达量上调至对照的1.5倍，4～12 h保持2倍的表达量，36 h时下降至对照水平以下，推测SmNAC1可能参与了丹参毛状根对YE+Ag+的胁迫应答调节。
[关键词] 丹参;NAC转录因子;SmBF3-2;分子克隆;生物信息学
NAC转录因子是植物中最大的转录因子家族，在植物的生长调节以及逆境应答分子网络中扮演着极其重要的角色，目前为止已经从拟南芥中鉴定出117个NAC转录因子基因[1-2]，水稻中151个[3]，葡萄中143个[4]，毛果杨中163个[5]，烟草[6]和大豆[7]中各有152个。NAC家族转录因子N-端有一个高度保守的NAC结构域，可进一步分为A-E5个保守的子域，具有DNA结合(DNA Binding)或蛋白质和二聚体结合功能。与N-端的保守不同，NAC的C端无论是在氨基酸序列还是长度方面都具有高度的多样性，具有转录激活、抑制或者与蛋白质结合活性[8]。实验证明不同物种的高同源性NAC基因可能执行不同的功能。NAC基因参与介导胁迫对植物生长发育的影响，这往往是生物胁迫间、非生物胁迫间以及生物与非生物胁迫间信号调控通路的关键节点[9]。目前关于NAC的研究较少，且多集中于拟南芥、水稻等模式植物。在丹参中仅克隆到1条NAC转录因子SmBTF[10]。本研究组从丹参毛状根cDNA文库中得到1条NAC转录因子的EST序列，在此基础上克隆得到了SmNAC1基因的全长cDNA序列，并通过生物信息学分析其编码的蛋白质理化性质、保守功能域等生物学信息，为进一步研究丹参中该类转录因子提供信息和依据。
1 材料
用丹参叶片经农杆菌ACCC10060介导产生的不定根[11-12]，用6，7-V培养基继代， 恒温26℃，80 r·min-1摇床暗培养培养18 d，用终浓度30 mmol·L-1Ag+和100 g·L-1酵母提取物联合处理， 0，2，4，8，12，24 h取样，液氮速冻，-80 ℃保存。
2 方法
2.1 RNA提取与反转录 采用Trizol法提取丹参毛状根总RNA。取0.1 g毛状根，加入0.2 mg聚乙烯聚吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone，PVPP)，在液氮中研磨粉碎，加入1 mL Trizol(Ambion公司)室温放置10 min充分裂解，4 ℃ 12 000 r·min-1离心取上清，依次用氯仿和异丙醇洗脱，75%乙醇-20 ℃沉淀2 h，最后用20 μL去除RNA酶的水溶解。用NANO Drop核酸定量仪测定RNA浓度，取1.0 μg RNA，应用Thermo反转录试剂盒，按照附带的操作流程利用Oligo(dT)18引物反转录成总cDNA。
2.2 SmNAC1cDNA全长克隆 根据得到的SmNAC1基因片段设计PCR特异性引物SmNAC1-F：5′-ATGACTCAATCCCAGGAGGAG-3′，SmNAC1-R：5′-CTAGTTTGTGAGCTCCATAATGG-3′，以丹参毛状根总cDNA为模板进行PCR扩增。扩增体系为ddH2O 15.4 μL，dNTP 1.6 μL，Ex Taq Buffer 2.0 μL，引物(10 nmol·L-1)各0.4 μL，Ex Taq(5 U·L-1)0.1 μL。扩增条件为95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min， 30个循环，72 ℃延伸10 min。1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。用Thermo Gene JET PCR纯化试剂盒纯化PCR产物后连接pGEM-T easy载体，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，挑取阳性单克隆送北京华大基因研究中心测序。
2.3 SmNAC1生物信息学分析 将全长cDNA序列在NCBI数据库的 ORF Finder中分析SmNAC1序列的ORF，推导编码氨基酸的基因序列。应用BLAST程序索相似蛋白，用Clustal W(对氨基酸序列进行多重比对，并用MEGA4 NJ法(bootstrap 1000)构建系统树。在CCD数据库)，InterProScan和ExPASy ScanProsite分析保守结构域，用Compute pI/Mw预测蛋白的理化性质。用TMHMM2.0进行跨膜域分析。SignalP 4.1 Server进行信号肽分析。WOLF PSORT和TargetP1.1Server分析蛋白的亚细胞定位。在CFSSP进行二级结构预测，Disulfind进行二硫键预测。在Swiss-Model进行蛋白的三级结构预测。
2.4 丹参毛状根中SmNAC1表达谱分析 采用SYBR Green Premix染料(TaKaRa公司)进行qRT-PCR分析，以丹参β-actin作管家基因，分别以特异性引物SmNAC F：5′-CTCCCAACATCAGTCAAG-3′，SmNAC R：5′-ATGGCGGTGACGAT-3′，检测SmNAC1在YE+Ag+处理丹参毛状根0，2，4，8，12，24 h的表达变化。PCR体系为 SYBR Premix TaqTM 5 μL，正反引物各0.2 μL，ROX Reference Dye II 0.2 μL，稀释10倍的cDNA模板1.0 μL，加ddH2O至10 μL。PCR程序为，95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s， 40个循环，增加溶解曲线。每个样品设3个生物学重复。
3 结果
3.1 丹参SmNAC1基因序列分析 丹参SmNAC1基因全长591 bp，编码196个氨基酸。Blastx检索结果显示，SmNAC1与野生马铃薯Solanum chacoense的NAC1，番茄S. lycopersicum NAC1-like，烟草Nicotiana benthamiana NAC1，水稻Oryza sativa Indica Group NAC-like，紫花苜蓿Medicago truncatula的相似度分别是84%，83%，84%，77%，73%。与SmBTF的相似度只有56%。SmNAC1蛋白55～120 位是NAC_AB(PS51151)的保守结构域。应用Softberry分析调控元件和PLANTCARE预测，C-端氨基酸有23个顺势作用元件，包括TGGTTT厌氧响应顺式调控元件，AAACAGA赤霉素响应元件，GTTTTCTTAC参与胁迫防御应答的顺式作用元件以及TCTTTAC光应答元件等。使用NetPhos 2.0 Server分析磷酸化位点，共发现10个磷酸化位点，其中丝氨酸位点7个，苏氨酸位点2个，酪氨酸位点1个，没有发现糖基化为点。
3.2 SmNAC1编码蛋白质的基本性质分析 SmNAC1蛋白由196个氨基酸残基组成，相对分子质量为21.66 kDa，等电点4.36。CFSSP 对SmNAC1蛋白进行二级结构预测，该蛋白包含87.8%的α螺旋结构， 36.7% 的β折叠结构和14.8%的无规卷曲，见图1(由于α螺旋和β折叠交互计算，故几种结构类型之和>100%)。无规则卷曲主要位于55～120个氨基酸功能区内，连接其他二级结构元件。在SWISS-MODEL用同源建模方法以人的NAC蛋白(3mcbA)为模板构建同源模型，对SmNAC1的NAC结构域氨基酸进行三级结构预测，结果见图2。SignalP 4.0 Server和TMHMM 2.0分析显示SmNAC1非氨基酸序列没有信号肽，也不包含跨膜结构域，也不是分泌蛋白。亚细胞定位分析表明，该基因不定位于叶绿体或线粒体，推测可能定位在细胞核，具有DNA结合，激活，转录调控，乙酰化等功能。
以人的NAC蛋白(3mcbA)为模板，E=9.311 57e-17。将SmNAC1与Genbank中17个物种25种蛋白进行比对，应用MEGA4使用NJ法(bootstrap 1000)构建系统进化树。SmNAC1与茄科马铃薯S. chacoense NAC2(ScNAC2， ACB32231.1)，本氏烟N. benthamiana NAC(NbNAC，BAF46352.1)和番茄S.lycopersicum NAC(SINAC，XP_004249331.1)
亲缘关系最近，见图3。从图中可以看出NAC的变异率是比较高的，同一植物的NAC蛋白并不聚在一起，如拟南芥中的拟南芥Arabidopsis thaliana中的5个蛋白NAC1-1(AtNAC1-1，NP_187845.1)，NAC1-2(AtNAC1-2，NP_190516.1)，NAC1-3(AtNAC1-3，NP_1196889.4)，NAC1-4(AtNAC1-4，NP_001078369.1)和NAC1-5(AtNAC1-5，AEE31552.1)，AtNAC1-1和AtNAC1-3聚为一小支，AtNAC1-4和AtNAC1-5聚为一小支，而AtNAC1-2则和蓖麻Ricinus communis NAC1-2(RcNAC1-2，XP_002521293.1)聚为一小支，三者间间隔距离较远。玉米种的3个NAC蛋白中ZmNAC1-1(NP_001147422.1)和ZmNAC1-3(NP001148944.1)聚为一支，与ZmNAC1-2(NP_001147705.1)的距离较远。水稻中的3个NAC蛋白则各自聚在不同的分支。可见NAC蛋白虽然具有保守的结构域，但是其结构的变异性非常大。
3.3 SmNAC1基因表达谱分析 对培养18 d的丹参毛状根进行YE+Ag+处理，分析SmNAC1在处理后5个时间点的mRNA水平的相对表达量，见图4。处理后2 h表达量上调至对照的1.4倍，处理后4 h表达量达到对照的2倍，8～12 h保持2倍的表达水平，处理后24 h SmNAC1下调至对照表达水平以下。说明SmNAC1响应YE+Ag+处理，参与了胁迫应答反应。
4 讨论
NAC家族基因是陆生植物特异的转录因子家族，NAC蛋白参与植物的生长发育、形态建成及多马铃薯Solanum chacoense NAC2(ScNAC2， ACB32231. 1);本氏烟Nicotiana benthamiana NAC(NbNAC，BAF46352. 1);番茄S. lycopersicum NAC(SINAC，XP_004249331. 1);丹参Salviae miltiorrhizae NAC1(SmNAC1，kF006346);黄瓜Cucumis sativus(CsNAC， XP_004171778. 1);葡萄Vitis vinifera NAC2(VvNAC2，XP_003632619. 1);野草莓Fragaria vesca subsp. vesca NAC(Fvssp. vescaNAC，XP_004306474. 1);拟南芥Arabidopsis thaliana NAC1-3(AtNAC1-3，NP_1196889. 4);拟南芥A. thaliana NAC1-1(AtNAC1-1，NP_187845. 1);水稻Oryza sativa Japonica Group NAC1(OsNAC1，BAB89723. 1);水稻O. sativa NAC1-3(OsNAC1-3，AAT01337. 1);葡萄V. vinifera NAC1(VvNAC1，XP_002283581. 2);二穗短柄草Brachypodium distachyon NAC(BdNAC，XP_003557882. 1);玉米Zea mays NAC1-3(ZmNAC1-3，NP001148944. 1);玉米Z. mays NAC1-1(ZmNAC1-1，NP_001147422. 1);大豆Glycine max NAC(GmNAC，XP_003554096);蒺藜状苜蓿Medicago truncatula NAC1(MtNAC1，XP_003624883. 1);火炬松Pinus taeda NAC(PtNAC，AAF27917. 1);Micromonas sp. RCC299(Msp. NAC1，ACO64924. 1);Coccomyxa subellipsoidea C-169(CsuNAC1，EIE21909. 1);拟南芥A. thaliana NAC1-5(AtNAC1-5，AEE31552. 1);拟南芥A. thaliana NAC1-4(AtNAC1-4，NP_001078369. 1);水稻O. sativa NAC1-2(OsNAC1-2，AAM52321. 1);玉米Z. mays NAC1-2(ZmNAC1-2，NP_001147705. 1);拟南芥A. thaliana NAC1-2(AtNAC1-2，NP_190516. 1);蓖麻Ricinus communis NAC1-2(RcNAC1-2，XP_002521293. 1)。 种生物和非生物胁迫应答过程。如玉米的ZmSNAC1基因在低温、干旱、高盐及脱落酸处理后表达量显著上调，而水杨酸处理后表达下调[13]。葡萄中的VvNAC1基因响应病原菌、脱落酸、茉莉酸和乙烯处理表达上调[14]。在巴西橡胶树HbNAC1启动子序列中有多个CCAAT-box，EECCRCAH1，MYB2CONAENSUSAT元件识别MYB和MYC转录因子，在ABA信号通路和非生物胁迫答应中起重要作用[15]。SmBTF3与SmNAC1氨基酸序列的相似度只有56%，但是在N-端都具有NAC-AB保守结构域，二级结构都以α螺旋为主。荧光定量PCR分析表明SmBTF3在根中的表达量最高，对ABA诱导的响应不明显，干旱胁迫短时间内抑制其表达。本研究发现SmNAC1在YE+Ag+联合处理后2 h表达量上调至对照的1.4倍，4 h上调至对照的2倍，24 h表达量下调至对照表达水平一下，可见丹参中的这2个转录因子在丹参的抗逆胁迫中起作用。
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