elisa常用方法

elisa常用方法

　　酶联免疫吸附测定(ELISA)为免疫学中的经典实验。下面是学习啦小编为您带来的elisa常用方法，希望对大家有所帮助。

　　elisa常用方法：双抗体夹心法

　　双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法。夹心法利用两种一抗对目标抗原进行捕获和固定，在确保灵敏度的同时大大提高了反应的特异性，该方法的检测灵敏度可提高到pg级的水平。将已知抗体包被到固相表面，加入待检标本，标本中若含有相应抗原即与固相表面的抗体结合，洗涤去除未结合成分，加入该抗原特异的酶标记抗体，洗去未结合的酶标记抗体，加底物后显色。若标本中无相应抗原，固相表面即无抗原结合，加入的酶标记抗体则不能结合于固相并被洗涤去除，当加入无色底物后，因无酶催化故不显色。双抗体夹心法适用于测定2价或2价以上的大分子抗原，但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。

　　elisa常用方法：间接法

　　间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。先将待测的蛋白包被在孔板内，然后依次加入一抗、酶标记的二抗和底物显色，通过仪器(例如酶标仪)定量检测抗原。这种方法操作简单但由于高背景而特异性较差，目前已逐渐被夹心法取代。间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标二抗建立检测相应抗体的方法。间接法成功的关键在于抗原的纯度。间接法中另一种干扰因素为正常血清中所含的高浓度的非特异性抗体。

　　elisa常用方法：竞争法

　　竞争法可用于测定抗原，也可用于测定抗体。当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。其原理为标本中的抗体一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。标本中?体量越多，结合在固相上的酶标抗体愈少，因此阳性反应呈色浅于阴性反应。如抗原为高纯度的，可直接包被于固相。如抗原中有干扰物质，直接包被不易成功，可采用捕获包被法，即先包被与固相抗原相应的抗体，然后加入抗原，形成固相抗原。洗涤除去抗原中的杂质，然后再加入标本和酶标抗体进行竞争结合反应。小分子抗原或半抗原因缺乏可用于夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，最后的显色也愈浅。

　　elisa结果判断：

　　定性测定

　　定性测定的结果判断是对受检标本中是否含有待测抗原或抗体作出"有"或"无"的简单回答，分别用"阳性"、"阴性"表示。"阳性"表示该标本在该测定系统中有反应。"阴性"则为无反应。用定性判断法也可得到半定量结果，即用滴度来表示反应的强度，其实质仍是一个定性试验。在这种半定量测定中，将标本作一系列稀释后进行试验，呈阳性反应的最高稀释度即为滴度。根据滴度的高低，可以判断标本反应性的强弱，这比观察不稀释标本呈色的深浅判断为强阳性、弱阳性更具定量意义。

　　在间接法和夹心法ELISA中，阳性孔呈色深于阴性孔。在竞争法ELISA中则相反，阴性孔呈色深于阳性孔。

　　定量测定

　　ELISA操作步骤复杂，影响反应因素较多，特别是固相载体的包被难达到各个体之间的一致，因此在定量测定中，每批测试均须用一系列不同浓度的参考标准品在相同的条件下制作标准曲线。测定大分子量物质的夹心法ELISA，标准曲线的范围一般较宽，曲线最高点的吸光度可接近2.0，绘制时常用半对数纸，以检测物的浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，将各浓度的值逐点连接，所得曲线一般呈S形，其头、尾部曲线趋于平坦，中央较呈直线的部分是最理想的检测区域。

　　测定小分子量物质常用竞争法，其标准曲线中吸光度与受检物质的浓度呈负相关。标准曲线的形状因试剂盒所用模式的差别而略有不同。ELISA测定的标准曲线注意图中横坐标为对数关系，这更有利于测定系统的表达。